香兰素的提取

实验香兰素的提取1、材料与方法1.1材料咖喱粉（姜黄粉）1.2试剂95%乙醇、无水乙醇、甲醇、NaOH、姜黄素、香兰素、硼酸、碳酸钠、氯化钠、盐酸、二氯甲烷、亚硫酸氢钠、环己烷，均为分析纯。D-101大孔吸附树脂、CAD-40大孔吸附树脂。1.3仪器设备HH-2数显恒温水浴锅；SHB-IV双循环水式多用真，空泵；FA2004N电子天平；22PC可见分光光度计；YHG-500-BS远红外快速干燥箱；AP-02B真空泵；RE-52A旋转式蒸发器；D7401-4型电动搅拌器；Waters515泵高效液相色谱仪；NovapakC18分析柱；lichrospherC18分析柱。1.4工艺流程由咖喱粉提取香兰素的工艺流程如图1所示。纯化重结晶高纯度姜黄素酸处理HCl碱处理NaOH姜黄素减压蒸发咖喱粉（姜黄粉）95%乙醇浸提真空抽滤吸附滤液倾析环己烷图1姜黄素的提取工艺流程1.5方法1.5.1乙醇法提取姜黄素姜黄素在95%乙醇中的溶解度较大，最大吸收波长为425nm，最大吸收值为0.695[7]。因此，在本研究中以印度咖喱粉为原料，选用95%乙醇作为提取剂，进行提取条件对提取率影响的实验。1.5.1.1温度对姜黄素提取率的影响称取5g咖喱粉，置于200ml烧杯中，加入95%乙醇100ml，分别调节水浴温度为35、45、55、65、75、85℃，加热2h，真空泵抽滤，记录下滤液的体积数，再将滤液稀释若干倍后，于425nm处测定吸光度并计算提取率。1.5.1.2时间对姜黄素提取率的影响称取5g咖喱粉，置于200ml烧杯中，加入95%乙醇100ml，调节水浴温度55℃，分别加热0.5、1、1.5、2、2.5h，真空泵抽滤，记录下滤液的体积数，再将滤液稀释若干倍后，于425nm处测定吸光度并计算提取率。1.5.1.3固液比对姜黄素提取率的影响称取5g咖喱粉，置于200ml烧杯中，分别加入95%乙醇25、50、75、100、125、150ml，调节水浴温度55℃，加热2h，真空泵抽滤，记录下滤液的体积数，再将滤液稀释若干倍后，于425nm处测定吸光度并计算提取率。1.5.1.4提取次数对姜黄素提取率的影响称取5g咖喱粉，置于200ml烧杯中，加入95%乙醇100ml，调节水浴温度55℃，加热2h，真空泵抽滤，记录下滤液的体积数，再按同样的条件提取2、3、4次，将滤液合并，再将滤液稀释若干倍后，于425nm处测定吸光度并计算提取率。1.5.2大孔树脂吸附法精制姜黄素根据本研究的目的，选择弱极性的D-101型和非极性的CAD-40型大孔吸附树脂分别进行吸附实验，比较二者的吸附性能。1.5.2.1大孔树脂的预处理分别称取D-101型和CAD-40型大孔吸附树脂各100g，置于烧杯中，加入95%乙醇充分浸泡4h，从孔中赶出空气泡。浸泡后，用蒸馏水冲洗三次。再用5%氯化钠溶液洗三次，5%碳酸钠溶液洗三次，以去除痕量的防腐剂和残留的单体化合物。再用蒸馏水反复洗至中性。1.5.2.2大孔树脂的选择分别称取相同质量已预处理的两种树脂于100ml的锥形瓶中，再各加入乙醇法提取的姜黄素稀释液，然后将锥形瓶放在振荡器上振荡24h，至吸附饱和，每隔一段时间测定吸附液在425nm的吸光度，计算两种树脂对姜黄素的吸附率。取己经吸附了姜黄素的两种大孔树脂于100ml的锥形瓶中，在室温下各加入无水乙醇，静态解吸6h，每隔1h测定解吸液在425nm的吸光度，从而计算两种树脂的解吸率。分别取5ml洗脱液进行硼砂实验，检定洗脱液中是否含有姜黄素，然后根据两种树脂的洗脱液在425nm处的吸光度，选择具有相对深颜色且吸光度大的洗脱液的大孔树脂。最后将解吸液在旋转式蒸发器中蒸发回收乙醇。1.5.3由姜黄素转化为香兰素的工艺研究1.5.3.1酸碱处理在配有搅拌装置、水浴装置和冷凝器的三颈烧瓶中，加入水和NaOH，再加入姜黄素，加热回流24h后，搅拌加入HCl溶液(pH1)，再加入二氯甲烷，倾析。回收下层水的液相部分，为溶液A。1.5.3.2亚硫酸氢钠处理室温下于三颈烧瓶中加入水和亚硫酸氢钠，再将溶液A加入，倾析，回收上层水相，得到溶液B。在同一烧瓶中加入溶液B和二氯甲烷，慢慢加入37%HCl，倾析，回收下层有机相，得到溶液C，浓缩，最后在环已烷中重结晶，得到纯香兰素产品。1.5.4香兰素的测定方法目前常见的香兰素含量测定方法有:薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、硫代巴比妥酸法、离子选择电极法等。本研究中选用高效液相色谱法和硫代巴比妥酸法进行香兰素的检测。香兰素标准溶液的配制：称取香兰素固体纯品0.1000g于5ml烧杯中，以甲醇溶解，再移入100ml容量瓶中，定容至刻度，相当于香兰素1.00mg/ml。样品的配制及处理：称取样品0.03g于5ml烧杯中，以甲醇溶解，再定容至10ml容量瓶中。取1ml12000r/min离心20min，再取5μl上清液进样，进行色谱分析。色谱条件：SpherisorbC18柱(250mm×4.6mm，5μm)为固定相，甲醇:水=35:65为流动相，流速为1.000ml/min，柱温为35℃，紫外可变波长检测器，检测波长λ：280nm，进样量：5μl，等梯度洗脱，以保留时间定性。2结果与分析2.1乙醇法提取姜黄素的单因素试验以印度咖喱粉为原料，95%乙醇为提取液，在水浴中加热一段时间，提取中间产物——姜黄素，并考虑温度、时间、固液比和提取次数对其提取率的影响。2.1.1浸提温度对姜黄素提取率的影响由图2可以看出，吸光度先随温度的升高而增大，在65℃时基本上达到最大值，随后迅速下降，可见在65℃下升高温度有利于姜黄素的提取，但是当温度达到65℃以上后姜黄素开始降解，不利于姜黄素的提取，因此，提取的最佳温度为65℃。2.1.2浸提时间对姜黄素提取率的影响图3可以看出，吸光度先随时间的延长而增大，在1～1.5h期间，吸光度变化不明显，而到了1.5～2.5h阶段，吸光度迅速下降，可见在1.5h前对姜黄素的提取是有利的，提取时间过长会导致姜黄素降解，不利于姜黄素的提取，因此，最佳浸提时间为1.5h。2.1.3固液比对姜黄素提取率的影响由图4可以看出，在固液比为1:10～1:20范围之间，吸光度变化不是很明显，在固液比为1:20～1:25之间有着显著的提高，可见当固液比小于1:20时对姜黄素的提取是不利的，因此，最佳固液比为1:25。2.1.4浸提次数对姜黄素提取率的影响由图5可以看出，提取一次与提取两次时吸光度有着明显的差别，可见对姜黄素提取一次是远远不够的，但是提取两次与提取三次或四次吸光度则基本上保持不变，因此，从单因素分析看，提取次数定为两次足够。综合上述各单因素试验的结果分析，可得乙醇法提取姜黄素的优化工艺：浸提温度为65℃、浸提时间为1.5h、固液比为1:25，提取次数两次，姜黄素的提取率可达95.1%。2.2姜黄素的纯化2.2.1静态吸附实验两种大孔吸附树脂对姜黄素乙醇提取液的静态吸附实验结果如图6所示。由图6可知，D-101型大孔吸附树脂对姜黄素的吸附能力明显大于CAD-40型大孔吸附树=(A0×V0－Ae×Ve)/(A0×V0)×100，式中：A0为起始吸光度，Ae为平衡吸光度，V0为起始体积，Ve为平衡体积。可计算出大孔吸附树脂对姜黄素的吸附率分别为：D-101型大孔吸附树脂的吸附率为94.3%，CAD-40型大孔吸附树脂的吸附率为83.3%，从吸附率结果看，D-101型大孔吸附树脂较佳。2.2.2静态解吸实验D-101型和CAD-40型大孔吸附树脂对姜黄素的静态解吸实验结果如图7所示。分别取少量洗脱液滴于滤纸上，在90～100℃烘箱中放置2min烘干，滤纸斑点呈黄色，在黄色斑点上滴硼酸试剂(硼酸1g加5ml盐酸，溶于95ml无水乙醇中)，在室温下即慢慢变为红色，烘干后在红色斑点上滴加20%碳酸钠溶液，斑点迅速变为天蓝色，说明解吸液中含有姜黄素。由图7可以看出D-101型大孔吸附树脂的解吸能力比CAD-40型大孔吸附树脂强，通过解吸率(%)=(A×V)/(A0×V0－Ae×Ve)×100计算解吸率，D-101型大孔吸附树脂的解吸率为80.5%，CAD-40型大孔吸附树脂的解吸率为74.9%，比较发现D-101型大孔吸附树脂的解吸率较佳。综合静态吸附和解吸实验结果分析，D-101型的吸附和解吸性能均优于CAD-40型大孔吸附树脂，因此选择D-101型大孔吸附树脂进行姜黄素的纯化。2.3由姜黄素转化为香兰素2.3.1香兰素的转化在200ml三颈烧瓶中加入30ml蒸馏水和0.3gNaOH，搅拌至完全溶解，加入3g姜黄素，搅拌，得到深红色溶液，然后将三颈烧瓶浸入恒温水浴锅中，调节温度为100℃，加热回流24h后，停止加热，室温下冷却，然后搅拌加入3mlHCl，搅拌30min，这时形成深色的固体和暗黄的液相。在此固液混合物中加入15ml二氯甲烷，搅拌1h后将混合物转移至分液漏斗中，等静置分层后倾析，回收下层水的液相部分，得到黄色溶液A——香兰素粗品。2.3.2香兰素的纯化在200ml三颈烧瓶中加入30ml蒸馏水和2g亚硫酸氢钠，搅拌至完全溶解，将粗提得到的黄色溶液A加入反应器中，搅拌30min，停止搅拌，将溶液转移至分液漏斗中静置分层，倾析，高效液相色谱分析下层有机液相部分，发现无香兰素，然后回收上层水相，得到溶液B，倾去下层液相，再加入10ml二氯甲烷，在室温下搅拌，用移液管移取2ml37%HCl慢慢加入溶液B中，再用电动搅拌器搅拌1h，静置1h后倾析，回收下层有机相，得到溶液C，然后用旋转式蒸发器进行抽真空浓缩，最后在环己烷中重结晶，得到白色至黄色针状结晶。最终产品称得0.15g，得率为5.0%，总得率为3.6%。2.4高效液相色谱法检测香兰素由图8可知，香兰素标准样品的纯度为99.6%，在保留时间为7.807min时出现最大峰，由此定性检测样品中香兰素。由图9可知，在保留时间为7.807min附近出现一个峰，tR=7.740min，并计算机归一化得到此香兰素最终产品的纯度为90.7%。