香菇中糖类物质的分离与测定

香菇中糖类物质的分离与测定摘要：本实验采用热水浸提和乙醇醇沉的方法提取香菇多糖（Lentinan，LNT），利用正交法得出最佳提取粗多糖的方案，得到的粗多糖回收率为14.05﹪，再对得到的粗多糖进行定性、定量分析。用苯酚—硫酸法测定已提取出的粗多糖中单寡糖与多糖的含量为35.9%；经过薄层层析和纸层析法分析单糖的组成，其中组成多糖的单糖多属于葡萄糖和阿拉伯糖；用SepharsoseCL—6B柱层析法测定多糖的相对分子量约为5597.58道尔顿。气象色谱分析单糖含的结果是香菇多糖中的单糖种类有半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、岩藻糖等，其中含量较多的半乳糖和葡萄糖。关键字：香菇多糖回收率含量组成相对分子量SeparationandDeterminationofcarbohydratesinLentinusedodesAbstract：Thisexperimentextractsoflentinan(LentinanLNT)byusinghotwaterextractionandethanolalcoholprecipitationmethod.Theorthogonalmethodtogettheoptimumextractionofpolysaccharidesisthebestprogram,resultingpolysaccharidesrecoveryof14.05%,andthentogetcrudepolysaccharidequalitativeandquantitativeanalysis.ByusingPhenol-sulfuricacidmethod,extractedpolysaccharidessingleoligosaccharidesandpolysaccharidescontentwas35.9%;TLCandpaperchromatographyanalysismonosaccharidecomposition,themonosaccharidecomposesmostlyofglucoseandarabinose;RelativemolecularweightofpolysaccharidedeterminedbySepharsoseCL-6Bcolumnchromatographyisabout5597.58daltons.Theresultsofgaschromatographicanalysisofamonosaccharideisgalactose,glucose,arabinose,fucose,sugar,andothertypesofmonosaccharidesinthelentinan.galactoseandglucosearemuchmoreamongthem.Keywords：Lentinan;Recoveries;Content;Composition;Relativemolecularweight0引言：糖类化合物是中药的重要成分，随着现代生物化学与分子生物学的不断发展与进步，人们对糖的了解越来越多。而糖生物学研究对揭示生命本质，实现中药现代化，深入开发中药资源有着重要的意义。但是,目前多糖的研究主要以陆生植物为主,有些源于名贵中药,这不利于多糖应用与研究的进一步发展。因此物美价廉的香菇受到越来越多的关注。香菇（Lentinusedodes）是侧耳科（Plearataco）的担子菌，含有多种有效药用成分。尤其是香菇多糖（Lentinan，LNT）是一种宿主免疫增强剂（Hostdefense-tiator，HDP），它具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能。本团队以热水提取法获得香菇多糖（Lentinan，LNT），并对其理化性质，含量和组成进行了一定规模的研究分析，为香菇多糖的开发与利用提供了实验依据。1材料与方法1.1实验材料1.1.1材料：香菇1.1.2试剂（1）无水乙醇（2）无水乙醚（3）P2O5（4）浓硫酸（5）6%苯酚（6）葡萄糖（7）BaCO3（8）显色剂：苯胺-邻苯二甲酸正丁醇饱和水溶液展层剂：正丁醇：乙醇：水=4:1:5（体积比）标准糖样：甘露糖、木糖、半乳糖、葡萄糖等琼脂糖凝胶（12）洗脱液：生理盐水（9g/ml）蓝色葡聚糖及不同相对分子质量葡聚糖标准样1.1.3仪器（1）电子天平（2）烧杯（3）玻璃棒（4）恒温水浴锅（5）纱布（6）容量瓶（7）真空干燥器（8）分析天平（9）移液管（10）可见光分光光度计（11）水解管（12）滤纸（13）漏斗（14）毛细管（15）硅胶板（16）层析缸（17）烘箱（18）喷雾剂（19）层析柱1cm×90cm（20）恒流泵（21）记录仪（22）自动部分收集器（23）紫外检测仪1.2香菇中多糖的提取称取晒干的香菇30.32g，用剪刀剪碎成小块，用自来水浸泡约24h后，在80℃下煮提1.5h，用纱布过滤取滤液至铁钢中，再加入少量水按以上方法分别煮提1h、0.5h，将3次得到的滤液在120℃下浓缩至50ml以下，转移至两成为250ml烧杯中，加入3倍体积95%乙醇中，封上封口膜保存。醇沉后倒出上清，将沉淀3000r/min离心15min，取出沉淀，沉淀依次用无水乙醇、乙醚脱水，P2O5真空干燥过夜，即得粗多糖。1.3香菇中单寡糖与多糖的含量测定游离的单寡糖多糖中的己糖、糖醛酸在浓硫酸作用下，可脱水生成糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物。己糖生成的化合物在490nm波长处有最大吸收峰，吸收值与糖含量呈线性关系。因此可以通过测定单糖的吸收值来测定单糖的含量。利用此原理便可测定香菇中单糖的含量。1.3.1标准曲线的制定本实验的以葡萄糖为标准制定标准曲线，按照如下表格试剂量，分别向6个试管中加入不同量的试剂，并立即摇匀，室温放置10min后于490nm处测定光吸收值，以横坐标为多糖微克数，纵坐标为光吸收值，绘制葡萄糖微克数与光吸收值之间的标准曲线。试管编号葡萄糖/ml蒸馏水/ml6%苯酚/ml浓硫酸/mlA490nm001.00.52.510.20.80.52.520.40.60.52.530.60.40.52.540.80.20.52.551.000.52.51.3.2香菇中单寡糖与多糖含量测定将待测样品称取5mg，水溶并定容至50ml，然后取干燥洁净试管，将5mg/50ml待测样品、6%苯酚溶液、浓硫酸依次按照1.0ml：0.5ml：2.5ml的比例加入，混匀。冷却10min后，静置，以蒸馏水代替糖溶液作对照，在490nm下比色，并做3个重复。所得数值取平均值，对照标准曲线可得单寡糖与多糖含量。1.4香菇多糖的单糖组成分析—薄层层析与纸层析分析法本实验采用2种方法来测定香菇多糖中单糖种类，薄层层析法与纸层析法。薄层层析是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，以液体为流动相的一种层析方法，利用固定相对物质的吸附能力不同而使物质得到分离。本实验应用吸附薄层层析法，即以硅胶为吸附剂。根据同一块硅胶板中糖的Rf与标准糖的Rf相比较，即可对单糖的组成进行鉴定。其中溶质的移动速率Rf等于原点到层析斑点中心的距离与原点到溶剂前缘的距离的比值。纸层析法是以纸为载体分离不同物质的方法，固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为层析液，根据相同时间内不同样品与标准样移动的距离来确定单糖种类。1.4.1薄层层析分析法（纸层析方法与此相同，不再赘述）1.4.1.1香菇多糖酸水解将20mg待测糖样加1mol/l浓硫酸2ml，封管，100℃水解8h，固体BaCO3中和，过滤，浓缩至1ml。1.4.1.2点样点样时将硅胶板水平放置，用毛细管在预先标好的位置上（如制板前，在距硅胶板一段2cm处用铅笔画一直线，在直线上，以1.5cm间隔打点作为点样位置）分别点上标准样及待测糖样，点样斑点尽可能小，直径不大于4mm。待干后，重复点样3~4次，且待测糖样要点在中间。1.4.1.3展层将硅胶板放进层析缸内，点样端靠近展层剂，贮液槽内加入展层剂，硅胶板在此密封层析装置中展层。1.4.1.4染色待展层剂到达离层析板上沿1~2cm时，取出层析板，记录溶剂前沿，置60℃烘箱中烘干。后用喷雾器向硅胶板上喷洒显色剂（苯胺-邻苯二甲酸正丁醇饱和水溶液）再经100℃显色15min，即显色各层析斑点。1.4.1.5计算相对迁移率Rf测定每个斑点中心距加样原点的迁移距离，计算相对迁移率Rf。通过Rf判断样品中含有的单糖种类。1.5香菇多糖相对分子质量分布分析——SepharoseCL-6B柱层析法本实验主要采用凝胶过滤色谱对所提取的多糖进行相对分子的检测。凝胶过滤层析主要根据小分子可以进入凝胶网孔，移动进程长;大的分子则被排阻于凝胶颗粒之外，将随洗脱液从凝胶颗粒之间的空隙洗脱下来，移动路程短，迁移的速度快，这样就可以实现我们分离的目的。本小组首先使用了两个标准样，根据其洗脱体积和相对分子质量制作标准曲线，之后再根据待测样的洗脱体积，得出待测样的相对分子质量，详细步骤如下：1.5.1凝胶浸泡将琼脂糖凝胶用乙醇浸泡，胀后倒去不易沉下的较细颗粒。将溶胀后的凝胶抽干，用10倍体积的洗脱液处理约1h，搅拌后继续除去悬浮的较细颗粒。1.5.2装柱将琼脂糖凝胶分析住垂直装好，关闭出口，加入10cm缓冲液。将处理好的凝胶用等体积的洗脱液搅拌成浆状，自柱顶部沿管壁缓慢加入，待底部凝胶体积约1cm高时，再打开出口，继续加入凝胶浆，至凝胶沉积至刻度线（80cm）即可。装柱要求连续、均匀、无气泡。1.5.3平衡将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱入口相连，用2~3倍体积洗脱液进行洗脱和平衡（2~2.2./10min/管）1.5.4加样与洗脱将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将1ml样品（第一次加样为相对分子质量为15.3万，第二次为46.17万，第三次为待测样）沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出口，用少量洗脱液洗柱内壁2次，加洗脱液至液面4cm左右，接上恒流泵，调好流速（流速为2~2.2ml/10min/管），用9g/lnacl溶液开始洗脱。1.5.5收集与测定以BS-100A自动部分收集器收集，苯酚-硫酸法测定糖的分布，进而根据洗脱体积制作标准曲线。进而求出待测样品的相对分子质量。1.6气相色谱法测定单糖含量——多糖乙酰化方法1.6.1阳离子交换树脂的处理方法：95%的乙醇洗数次后浸泡过夜，80度烘干1M盐酸浸泡过夜，水洗至中性，烘干。1.6.2水解管验漏每只水解管中加入1ml无水乙醇，在相应位置划上线，盖紧盖子，烘箱中120℃3h，隔一会就要看一下，如果有漏的很快无水乙醇就会挥发，这个时候应该换换盖子，或者在盖子中加两个橡胶塞子，直到有相应个水解管不漏为止。验漏后，用胶布给每个水解管都编上号，管身和盖子上都要标记，这非常重要。倒掉无水乙醇，洗衣粉洗干净，大量清水冲洗，再用蒸馏水冲洗，烘干。1.6.3水解称取20mg粗多糖于水解管中，加入1ml三氟乙酸，拧紧盖子，烘箱中120℃3h，要划线，开始的时候要观察是否漏，若挥发，补加三氟乙酸，但浓度会变，尽量不要使其漏。1.6.4赶酸拿出水解管，凉一会儿，将样品转移至蒸发皿中，蒸发皿一定要刷干净，否则后续实验中一顿刮，肯定会影响实验结果，蒸发皿要做好标记，不要弄乱。用尽量少的无水乙醇将水解管洗干净，并转移至蒸发皿中，不断加入无水乙醇，以致PH至中性。无水乙醇也达不到中性，PH和其一致就行，1ml蓝色枪头上套一个红色的胶塞成滴管状，用其加入无水乙醇，有一个公共的滴管，每个样品一个，千万不要将样品弄混，蒸发的过程会出现一圈圈的杂质，边蒸发边使其进入液体中（有糖）。尽量使蒸发的体积控制在最小，这样赶酸会比较快。PH达到中性偏酸后，用无水乙醇将对应的水解管冲几遍，将样品转移至水解管中，向蒸发皿中加入无水乙醇，冲几次，浓缩一下，不要使其体积过大，水解管装不下，体积大概控制在水解管的四分之三处。1.6.5真空泵抽干将1ml枪头从下面切开，装在真空泵的胶管上，打开真空泵，将枪头慢慢靠近水