第八章分光光度分析、电化学分析及自动化技术

第五章常用生物化学检验技术临床生化检验常用的分析技术有光谱分析技术、电化学分析技术、电泳分析技术、层析和离心分析技术及自动化分析技术。其中光谱分析技术是最基本和最常用的技术，它具有灵敏、准确、快速、简便、选择性好等特点而被广泛应用。第一节光谱分析技术光谱技术是根据物质吸收或发射辐射能而建立起来的一类分析方法，因不同分子的原子团和原子，其发射光谱和吸收光谱不同，而相同的物质在一定条件下，其发射光谱和吸收光谱的强度与该物质的含量成正比关系。因此可对物质进行定性和定量分析，此类技术称为光谱技术。是一种最常用的生化检验测定技术，它主要包括吸收光谱（可见紫外、红外原子吸收光谱法）、发射光谱（荧光法、火焰发射光谱法）和散射光谱（比浊法）。光是一种高速传播的电磁辐射，具有波、粒二象性，光的波长（λ）的常用单位纳米（nm），可见光波长400～760nm，＜400nm称为紫外光，＞760nm称为红外光，波长愈短，能量愈大。可见，紫外吸收光谱是由于多原子分子的价电子在电磁辐射的作用下，由基态跃迁到激发态，这种因物质分子对辐射的选择性吸收而得到的光谱称为吸收光谱。处于高能态的分子（激发态分子）是不稳定的，当返回基态时，便发射出相应的光谱，称为发射光谱。可见，紫外吸收光谱用于定量分析的依据是光的吸收定律，即Lambert-Beer是律，它是吸收光谱法的基本定律。一、分光光度法的基本原理（一）吸光度与透光度当光线通过均匀、透明的溶液时，一部分光被散射，一部分光被吸收，另一部分光透过溶液。设入射光强度为Io，透射光强度为It，It与Io之比称为透光度（T），即IoIt=T）透光度（T常用百分数表示（T%），也称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度（A），又称为消光度（E），光密度（OD），即ItIolg=IoItlg－=Tlg－=A吸光度与透光度的换算：Tlg－100lg=T1lg=Tlg－=A如透光度=10％时A=lg100－lg10=2－1=1透光度=20％时A=lg100－lg20=2－1.3=0.7（二）Lambert-Beer定律1.Lambert定律当一束强度为Io的单色光透过某种吸光溶液后，由于溶液吸收了一部分光，则透过的光线为It。当溶液浓度不变时，透过的液层愈厚，则光线强度的减弱愈显著。吸光度随液层厚度增加而增加，其关系是吸光度（A）与液层厚度成正比，即L∝ItIolg=IoItlg－=Tlg－=A将上述比例式写成等式，则引入比例常数，即吸光系数（K），得A=K·L当溶液浓度不变时，吸光度与液层厚度成正比，这就是Lambert定律。2.Been定律当一束强度为Io的单色光透过某种吸光溶液后，若液层厚度不变，而浓度不同时，溶液的浓度愈大，则透过光的强度愈弱，其定量关系是：C•＝KItIolg=A当液层厚度不变时，吸光度与溶液浓度成正比，这就是Beer定律。合并Lambert定律和Beer定律C•L•K=ItIolg=Tlg－=A即Lambert-Beer定律是说明吸光物质对单色光吸收的强度与该物质的浓度和液层厚度成正比。εmol1cm·λ溶液的吸光强度与浓度的关系，如用坐标表示，即A-C曲线呈正比易制图，使用方便（三）吸光系数吸光系数K的物理意义是吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度，在给定条件下（波长、溶液性质、浓度）吸光系数是物质的特征常数，K值愈大，能测定的浓度C愈小，则灵敏度愈高。吸光系数的表示方法1.摩尔吸光系数用表示，其意义是浓度为1mol的溶液在厚度为1cm时的吸光度。）（）（cmL•L/molCA=mol•cm12.百分吸光系数或称比吸光系数，用E%1•cm1表示，是指浓度为1％（W/V）的溶液在厚度为1cm时的吸光度。）（）（cmL•dl/gCA=E%1•cm1换算关系：M10•=E%1•cm1mol•cm1二、分光光度计的基本结构分光光度计由光源、单色光器、比色杯、光电管、运算放大器和显示器等部分组成。1.光源2.单色光器3.试样室4.光电管5.运算放大器6.显示器图5-1分光光度计结构示意图（一）光源可见光分光光度计常用光源是钨灯，能发射出350nm～2500nm波长范围的连续光谱，适用范围是360nm～1000nm。现常用的是卤钨灯，发光效率提高，使用寿命延长。紫外分光光度计常用光源是氢灯，其发射波长范围为150nm～400nm。（二）单色光器将光源的复合光分散为单色光的装置称为单色光器。常用的单色光器有滤光片、棱镜和光栅。（三）比色杯盛放比色溶液的装置。用无色透明、耐腐蚀、耐酸碱的玻璃或石英材料做成。光径有0.5～5cm，比色杯间的透光度误差应小于0.5%。（四）检测器由光电管和运算放大器组成，是将光信号转换成电信号，并将电信号放大的装置。（五）显示器是将检测器所检测的电流通过仪表显示出来的装置。常用的有检流计和数字显示器。检流计可显示透光度（T%）和吸光度（A），数字显示器可显示T%、A和C（浓度）。三、分光光度法的定量方法1.对比法又称标准对照法，通常在测定未知浓度样品的同时，测定一已知浓度的标准液作比较，然后分别测定两者的吸光度。SSSC•L•K=ItIolg=ARRRC•L•K=ItIolg=A因测定成分相同，故a值相同，比色时用同样规格的比色皿故bS=bR，所以比色分析中测定标准液与未知液吸光度的比值也就等于其浓度的比值，即RSRSCC=AASSRRC×AA=C若标准液与样品用量不等时，则再乘上RSVV。用对比法进行定量时，为了减少误差，选用标准液浓度应尽可能接近待测样品浓度。2.标准曲线法配制一系列浓度不同的标准液，按一定操作方法显色后，用选定的波长分别测定它们的吸光度，然后以吸光度为纵坐标，标准液浓度为横坐标，在坐标纸上标出各坐标点，通过原点连接各点应成一直线，即A-C曲线。注意事项：（1）应设置5～6个浓度。（2）设置的浓度范围应足够大，直至观察到“拐点”（即不呈直线的浓度值），或到能满足临床应用的浓度为止，以便能准确地划出线性范围。（3）每一种浓度最好是做三个平行测定，并要求3支平行管吸光度的最大值与最小值之差应小于0.05，然后求平均值。（4）校正有时制备的标准曲线C与A相交的点不一定完全在一条直线上，定线时若采用目测法校正，如校正不当，反面会造成更大的误差，科学的方法采用直线回归方程来确定直线的位置，其计算方式是y=a+bx22x－x•ny•xxy－•n=b）（nx·bya四、其它光谱分析技术（一）火焰光度法是一种发射光谱分析法，是利用火焰使金属元素激发后，能发射出特征性谱线的特点进行测定的一种方法1.基本原理某些金属元素的基态原子受到火焰的激发后，其外层电子获得能量而从基态跃迁到激发态，接着它们又以发射光谱的形式释放出所获得的能量，而返回基态，在相同条件下，同一元素所释放的单位能量相同，故能形成固定光谱。而不同的元素受激发后所发射光谱不同。如钠发射光谱波长589nm，钾发射光谱波长767nm由于火焰供给的能量不强，只能激发碱金属和碱土金属元素，生化检验中常用于钾、钠的测定。元素的发射谱线强度与该元素浓度的关系可表示为：I=a·cba是与试样组成、及其蒸发和激发过程有关的常数，b为自吸收系数，在浓度很低时，b≈1，所以上式可写成I=a·c，即发射谱线强度与待测元素浓度成正比。2.火焰光度计的基本构造基本结构主要分三个部分：激发光源系统、光学系统、检测显示系统（二）荧光分析法暗利用某些物质受紫外光照射后发出特有的荧光，籍此对物质进行'定性，定量分析的方法。1.基本原理某些物质的分子吸收了光能，从基态跃迁至某一电子激发态中的某一振动能级，处于激发态较高振动能级中的分子通过运动或与其他分子的碰撞而将过多的能量转给其他分子，并返回到第一激发态的最低振动能级，然后发生自发辐射，跃迁到基态，发射一定波长的辐射能，此能量即荧光，荧光多为可见光，在一定浓度范围内，其荧光强度与溶液浓度呈线性关系，是量关系式可表示为：F=φfIoεbc=KcK为常数，它与物质的性质，激发光强度、波长、液层厚度等条件有关。此公式是荧光分析的定量基础，但它只适合于稀溶液，即εbc项不大于0.05，因此线性范围的最大浓度为Cmax=b05.0。当溶液浓度超过Cmax时，荧光强度与浓度不呈线性的。2.影响荧光强度的因素（1）温度、pHT↑，分子碰撞频率↑，因此荧光强度随温度升高而减弱。pH可影响化合物电离或使荧光物质水解，如苯胺在pH7～12溶液中主要的分子形式存在，产生蓝色荧光，而在Ph＜2或＞13的溶液中以离子形式存在，不能产生荧光。（2）激发光和发射光在定量测定时，一般应选择荧光物质的最大激发波长（λex）和最大荧光波长（λem），但有些荧光物质化学性质不稳定，受激发光照射后易分解，缩短样品照射时间，改变激发光波长。（3）物质浓度的影响荧光分析只适合稀溶液，因荧光物质浓度高，分子间碰撞增加，使荧光强度减弱，这种现象称为自熄灭，自熄灭现象随浓度增加而增强。3.仪器与测定方法作为荧光分析的仪器有光电荧光计和荧光分光光度计。光电荧光计的结构与光电比色计很相似，不同之处是检测器与光线成直角，并多一块滤光片。如将滤光片改为棱镜或光栅作单色器，就和可见紫外分光光度计相似而成荧光分光光度计。四类仪器的组成部件的比较光源单色器测定池光敏元件检测器光电比色计钨灯滤光片玻璃（二面透光）光电池光电管检流计光电荧光计卤钨灯（300-700nm）两块滤光片玻璃（四面透光）光电管检流计可见、紫外分光光度计钨灯（400-760nm）氢灯（200-400nm）光栅或棱镜玻璃石英光电管光电倍增管自动记录仪荧光分光光度计氙弧灯（200-700nm）光栅或棱镜玻璃石英光电倍增管自动记录仪氙弧灯发射的强烈紫外线对人眼有害。荧光分析优点：（1）灵敏度高比可见紫外吸收光谱高103～104倍。（2）特异性强通过选择合适的激发光波长和荧光波长可避开其它物质干扰。（3）操作简便、快速、重现性好。（4）样品用量少不足之处：（1）应用范围有一定局限性，因许多物质不能产生荧光。（2）对测定条件要求严格，如试剂、溶剂不应含有荧光杂质。（3）仪器价格较贵荧光分析法在医学检验中可用于测定类固醇激素（肾上腺皮质激素、性激素）及代谢产物，单胺类神经递质（几茶酚胺，5-HT），某些维生素（VitA、B族）。（三）原子吸收分光光度分析属吸收光谱分析1.基本原理：待测元素经原子蒸气发生器转化成气态原子（处于基态），由空心阴报灯提供的待测元素的其振线经过待测元素的蒸气，共振辐时强度被蒸气中待测元素的基态原子吸收而减弱，其吸收规律遵循Beer定律，即在一定条件下，原子吸收与该物质浓度成正比。共振线：电子从基态跃迁至第一电子激发态的最低振动能级所吸收的谱线的为共振吸收线。简称为共振线。2.组成由光源、原子化器、分光系统和检测系统组成。（1）光源有空心阴极灯、无极放电灯和蒸气放电灯。（2）原子化器将待测元素转化为基态原子。（3）分光系统将待测元素的特征谱线与其它谱线分开。由透光狭缝、色散元件和准直镜组成。（4）检测系统将光信号转化为电信号并进行放大处理，确定待测元素的含量。由检测器和放大器组成。3.应用：在医学检验中主要用于体液、毛发、指甲等组织钙、镁、铁、钠、锌、铝、汞、铅、砷等多种元素的测定。优点：（1）选择性好，受干扰少，原子吸收是光的窄带吸收，仅0.001～0.01nm，而分子对光的吸收是宽带吸收，达几个nm。（2）灵敏度较大火焰光度分析高1～2个数量级（3）测定快速、简便（4）应用范围广，可测多种元素，但需更换不同空心阴报灯，仪器昂贵。第二节电化学分析电化学分析是一种以溶液电化学性质为基础测定物质含量的分析方法。按测定量的电化学参数的不同，可分为电位法、电导法、库仑法、极谱法和伏安法等，下面主要介绍电位法中的离子选择电极法。离子选择电极（ionselectiveelectrode，ISE）是一种电化学敏感器，它的电势与溶液中给定离子的活度的对数成线性关系，故可以通过简单的电位测量，直接测定溶液中离子活度。离子浓度与离子活度的关系a=f.c在稀