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~1~目录一立题依据---------------------------------------2二主要研究内容-----------------------------------2三技术路线---------------------------------------5四要达到的技术或经济指标-------------------------6五经济效益分析-----------------------------------9六研究进度--------------------------------------10七风险分析--------------------------------------10八项目组成员------------------------------------11~2~一立题依据(1)马铃薯是高度杂合的，因此它们的种子后代不可能与原种完全相同。只有由无性繁殖产生的植株，在遗传上才能与其亲本植物完全相同，从而使品种的特性代代相传。利用植物组织培养技术，在无菌条件下对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法称为植物离体无性繁殖。马铃薯试管苗在光照条件下进行自养的程度大于异养。相反，在高浓度的糖类存在的情况下，以及在无光照的限制条件下，马铃薯向着诱导生成试管薯的过程。这样生长出来的试管薯称之为原种种薯。(2)短枝发生型是指外植体携带的带叶茎段，在适宜的培养环境中萌发，形成完整植株，再将其剪成带叶茎段，继代再成苗的繁殖方法。该方法与田间枝条的扦插繁殖方法类似，故又称为微型扦插。能一次成苗，遗传性状稳定，培养过程简单，移栽成活率高。许多花卉、葡萄、马铃薯等试管苗的繁殖常用此方法。(3)在黑暗环境的诱导下，马铃薯试管苗可以在试管薯诱导培养基中结出种薯，且悬于茎秆上。马铃薯试管薯是利用茎尖分生组织脱毒技术，在组织培养条件下高倍扩繁脱毒试苗，进而诱导试管苗所形成的块茎。试管薯具有无病原、体积小、贮藏运输方便、能工厂化周年生产，从而为马铃薯优良种质的保全提供了一条理想的途径。二主要研究内容1研究方法：作为植物营养繁殖的一个新手段，植物组织培养技术现正日益普及。利用植物组织培养技术，在无菌条件下对外植体进~3~行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法称为植物离体无性繁殖(propagationinvitro)。植物离体无性繁殖又称植物快繁或微繁(micropropagation)，它是植物组织培养技术在农业生产中应用最广泛、产生经济效益最大的研究领域，涉及的植物种类繁多，技术日益成熟并程序化，繁殖速度突破了植物自然繁殖的界限，成就了工厂化育苗的梦想。植物快繁与传统营养繁殖(vegetativepropagation)相比，其特点表现在：①繁殖效率高。由于不受季节和灾害性气候的影响，材料可周年繁殖。生长速度快，材料能以几何级数增殖。②培养条件可控性强。培养材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下生长，便于对各种环境条件进行调控。③占用空间小。一间30m2的培养室可同时存放1万多个培养瓶，培育数十万株苗木。④管理方便，利于自动化控制。培养材料在人为环境中生长，省去了田问栽培的一些繁杂劳动，并可利用仪器进行自动化控制，便于工厂化生产。⑤便于种质保存和交换。通过抑制生长或超低温贮存的方法，使培养材料长期保存，并保持其生活力，既节约了人力、物力和土地，还防止了有害病虫的传播，更便于种质资源的交换和转移。2研究材料（1）马铃薯幼苗（2）培养基培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养基质。配制培养基时，为了减少试剂称取时的工作量和少量称取时出现的误差，以~4~及避免多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，预先要将各种营养成分配制为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到要求的浓度。母液的浓度为培养基浓度的10倍、100倍或更高。将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基。利用适宜的培养基，诱导带有腋芽的马铃薯单节茎段进行芽生长和根再生形成单苗，从而达到快速繁殖的目的。培养基配方设计：①根据培养的目的选择一种培养基为基本培养基。②确定培养基中各种激素的浓度及相对比例。本实验中马铃薯试管苗快速繁殖培养基培养基的配方如下：MS培养基+C30g/L+A7g/LPH5.83研究用具果酱瓶、500mL搪瓷杯、三角瓶、烧杯、容量瓶、玻璃棒、25mL量筒、1mL和5mL移液管、洗耳球、PH试纸、封口膜、扎口用棉线、药勺、称量纸、普通电子天平、酒精棉球、小块纱布、灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、超净工作台、冰箱、高压蒸汽灭菌锅、电磁炉、记号笔。4药品和试剂（1）母液配制：硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2,4-D(2,4-~5~二氯苯氧乙酸)、NAA（α-萘乙酸）、6-BA、浓盐酸、氢氧化钠、95%酒精、蒸馏水、75%酒精等。（2）马铃薯快速繁殖培养基及诱导培养基的配制：事先配好的MS基本培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH等。三技术路线1实验总体流程2母液配置流程~6~3马铃薯试管苗快速繁殖培养基的配制流程四要达到的技术指标1MS母液各种成分指标母液种类成分规定用量/mg.L-1浓缩倍数称取量/mg母液定容体积/mL配1LMS培养基吸取量/mL大量元素KNO319002038000100050NH4NO3165033000CaCl2.2H2O4408800MgSO4.7H2O3707400KH2PO41703400~7~母液种类成分规定用量/mg.L-1浓缩倍数称取量/mg母液定容体积/mL配1LMS培养基吸取量/mL微量元素MnSO4．H2O16.9200338010005ZnSO4.7H2O8.61720H3BO36.21240KI0.83166Na2MoO4.2H2O0.2550CuSO4.5H2O0.0255CoCl2.6H2O0.0255母液种类成分规定用量/mg.L-1浓缩倍数称取量/mg母液定容体积/mL配1L培养基吸取量/mL有机成分甘氨酸2.02001002505盐酸硫胺素0.15盐酸吡哆素0.525烟酸0.525肌醇1005000母液种类成分规定用量/mg.L-1浓缩倍数称取量/mg母液定容体积/mL配1LMS培养基吸取量/mL铁盐Na2EDTA.2H2O37.320037305005FeSO4.7H2O27.82780~8~母液种类成分称取量（mg）母液定容体积（mL）母液浓度（mg/mL）生长素2,4—D501000.5NAA501000.5细胞分裂素6-BA101000.1KT101000.12培养基基本配方：MS基本培养基＋0.7％琼脂＋3％蔗糖（每小组配制0.5L）（１）根据需要配制的培养基的量称好所需的琼脂（3.5g），放入医用口杯中，加入适量的蒸馏水（估计加入母液后不超过配制总量）置于电磁炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅动。（２）MS基本培养基配置：（配置前先检查各母液情况，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用）。大量元素母液：25ml；微量元素母液：2.5ml；铁盐母液：2.5ml；有机物母液：各2.5ml。混匀。（３）待琼脂完全溶解后，加入规定用量的蔗糖（15g），继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，再加入所需用量的母液（可事先取好放于一烧杯中），最后加蒸馏水至所需体积，即500ml。（4）调节培养基的酸碱性至pH5.8：由于培养基的pH值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大影响。此外，琼脂培养基的pH值还影响到凝固情况。所以，当培养基配制好后应立即进行pH值的调整。最好用酸度计测试，既快又准，如无条件也可用精密pH试纸。培养基若偏酸时用lmol·L-1NaOH来调节，偏碱则可用lmol·L-1HCl~9~来调节。一般来说，当pH值高于6.0时，培养基将会变硬；pH值低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。（5）培养基的分装：配制好的培养基要趁热分装，分装时容器口小者可采用漏斗分注，口大者直接加注。试管、三角瓶等培养容器加注量占其容积的1/4～1/3为宜，果酱瓶每瓶20～30ml，太多既浪费培养基，又减少了培养材料的生长空间；太少又会因营养不良影响生长。培养基分装完后，用封口膜封严瓶口，并用棉线扎紧。本次实验中500ml分装到10个果酱瓶，每人两瓶，剩余两瓶备用。（6）培养基的灭菌：培养基分装后应立即置于高压蒸气灭菌锅内进行灭菌。消毒灭菌时，压力表读数约为1.06kgf·cm-2或0.105MPa（可在0.105～0.12MPa间，但不得超过0.14MPa），温度121℃时保持15～30min左右即可。为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。排净冷空气的办法有两种：A、可以事前打开灭菌锅放气阀，煮沸，待大量热蒸气排出后再关闭；B、也可采用先关闭放气阀，待压力升到约0.04MPa，温度超过108℃时打开放气阀排出空气，待压力表指针回到0时再关闭放气阀。五经济效益分析1优良品系的繁殖快速。若培育出高产或优良的品种，可通过快速繁殖在极短的时间生产出大量的优良马铃薯。2保存少量植株组织即可保存完整的遗传信息。如果要对某些品种~10~进行遗传信息留存只需保留少量植株组织即可。3可实现工厂化生产。马铃薯是人们一年四季都可食用的食材，通过快速繁殖可以实现工厂化生产，打破了季节约束，能源源不断供应。4降低生产成本。通过快速繁殖在实现工厂化生产的同时也降低了生存成本，不仅为生存者带来了经济利益也降低了消费者的生活成本。六研究进度时间进度2014年12月第一周2014年12月第二周2014年12月第三周2014年12月第四周七风险分析在研究过程中可能会出现各种各样未知的状况，大致包括以下几种：（1）实验用具的损坏或丢失；所以在实验开始前要对每个实验用具进行检查确保都是完好无损，清点数量，在实验过程中谨慎进行，实验后再次清点。（2）研究结果与预期有差距或者完全不同；对于这种情况要进行多次实验，并尽可能多设置几组实验样本找出产生的原因。（3）研究经费超出预算；在研究过程中要秉着节约的意识进行实验，尽量避免不必要的开支~11~八项目组成员研究项目名称马铃薯快速繁殖的研究类别基础研究学科分类农学所属院校天津农学院组长姓名陈家水性别男班级设施1202电话18222497805学号1202154225