马齿苋粗多糖的提取及清除羟自由基活性作用

马齿苋粗多糖的提取及清除羟自由基活性作用首席医学网2007年09月07日10:34:18Friday205中华临床医师杂志征稿颅脑解剖技术研修班肝病学科新进展研修班心律失常现代诊疗会议医学类核心期刊征稿老年疾病循证应用会议小儿心血管疾病会议第13届国际急诊学大会临床检验及设备展览会白内障人工晶状体会议全国疑难重症肝病大会四届长城国际男科论坛2010世界心脏病学大会泌尿外科学临床研修班股骨头坏死修复论坛作者：朱晓宦吴向阳仰榴青范群艳茆广华作者单位：江苏大学食品与生物工程学院；化学化工学院；药学院，江苏镇江212013加入收藏夹《航空航天医药》由中华人民共和国科学技术部、...中华现代临床护理学杂志征稿[白内障患者术前术后护理][银翘散方小议]·参松养心胶囊胺碘酮治心律失常疗效比较·外固定器结合植骨治尺桡骨骨折后骨不连·中西医结合治疗消化性溃疡53例疗效分析·子宫瘢痕部位穿透性植入胎盘致引产出血·溃疡性结肠炎外科治疗体会真菌性鼻窦炎护理杂志：诚信征稿、发表快[腰椎术后并发症预防护理][中医心理疗法]·写作技巧|医学论文结果部分的写作技巧·快讯|《中国医药导刊》杂志征稿函【摘要】目的：研究马齿苋粗多糖的水提法优化工艺和清除羟自由基活性作用。方法：采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，以多糖提取率为考察指标，进行单因素实验，考察固液比、温度、时间、提取次数等因素对提取率的影响。在此基础上，进行正交试验，优化水提法工艺条件。采用水杨酸法考察马齿苋粗多糖清除羟自由基活性。结果：温度是影响粗多糖提取率的重要因素。水提法优化工艺条件为温度100℃、时间2h、固液比1∶15、提取次数4次，此条件下多糖提取率达94.26%，粗多糖得率为15.50%，多糖含量为22.60%。马齿苋粗多糖具有清除羟自由基能力，并且其清除能力与质量浓度有明显的量效关系，马齿苋粗多糖质量浓度为3.5mg/mL时清除率达50％，质量浓度为17.6mg/mL时清除率高达90％。结论：该优化工艺可用于马齿苋多糖的提取，高浓度马齿苋粗多糖具有较好的抗氧化活性。【关键词】马齿苋多糖提取工艺抗氧化羟自由基StudyonextractionandabilitytoscavengehydroxylradicalsforPolysaccharidesfromPortulacaoleraceaL.MAO(SchoolofFoodandBiologicalEngineering;SchoolofChemistryandChemicalEngineering;SchoolofPharmacy,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu,212013,China)［Abstract］Objective:TostudytheextractiontechnologyandantioxidantactivityofpolysaccharidesfromPortulacaoleraceaL.Methods：Thecontentofpolysaccharidesofbasisofsinglefactorstests,thefourfacandtheextractiontimesontheextractionrateofthepolysaccharideswerestudiedbyorthogonalexperimentaldesign.ThesalicylicacidmethodwasusedtoinspecttheabilitytoscavengehydroxylradicalsofthepolysaccharidesfromPortulacaoleraceaL.Results：Temperaturewasanimportantfactorfortheextractionrateofthepolysaccharides.Theoptimalextractiontechnologyconditionswerethatthetemperaturewas100℃,theextractiontimewas2∶15andtheextractiontimeswere4times.Theextractionrate,yieldandcontentofpolysaccharideswere94.26%,15.50%and22.60%,respectively.Thepolysaccharideshasgoodabilitytoscavengehydroxylradicals,andthescavengingabilityrelatedwiththeconcentrations.Thescavengingratewas50%attheconcentrationof3.5mg/mL,andthescavengingratewas90%attheconcentrationof17.6mg/mL.Conclusion：ThisextractiontechnologycouldbeusedfortheextractionofthepolysaccharidesfromPortulacaoleraceaL.Thepolysaccharideshasgoodantioxidantactivityatahighconcentration.［Keywords］PortulacaoleraceaL;polysaccharides;extractiontechnology;antioxidantactivity;hydroxylradicals马齿苋（PortulacaoleraceaL.）系马齿苋科马齿苋属一年生肉质草本植物，是药食同源野生植物之一，既是一种保健功能食品，又具有重要的药用价值。多糖是构成生命的四大基本物质之一，具有重要的生物活性。研究表明［1-3］，马齿苋多糖能活化巨噬细胞，增强机体免疫功能，并具有抗肿瘤作用，对油脂具有较强的抗氧化能力。但有关马齿苋多糖提取工艺的研究报道较少［4,5］。本文在单因素试验的基础上采用正交试验优化马齿苋多糖的水提工艺，并考察粗多糖清除羟自由基的活性，为马齿苋功能食品和药品的开发提供基础。1材料与方法1.1材料与仪器马齿苋干品：镇江江扬国药有限公司提供，经镇江市药检所陈黎主任药师鉴定为PortulacaoleraceaL，石油醚80℃脱脂12ｈ，35℃烘干备用。医用乙醇纯度为95%，其他所用试剂均为分析纯。型可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；旋转蒸发器（瑞士Büchi公司）；电子天平（北京赛利多斯仪器系统有限公司）。1.2实验方法1.2.1马齿苋多糖的提取称取适量马齿苋置于圆底烧瓶中，按一定固液比、水浴温度和浸提时间在热水浴中回流浸提数次，冷却后过滤，合并上清液；上清液减压浓缩后，加入一定体积95%乙醇，使终浓度为80%进行沉淀，所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤,干燥后得粗多糖样品粉末。1.2.2单因素实验影响多糖提取率的主要因素有温度、时间、固液比和提取次数等。本实验提取温度选取40℃、60℃、80℃、90℃、100℃5个水平，固液比选取1∶9,1∶11,1∶13,1∶5,1∶17,1∶20共6个水平，浸提时间选取１ｈ,２ｈ,３ｈ,4ｈ,5ｈ5个水平，提取次数选取1,2,3,4,5次5个水平，分别进行单因素试验。1.2.3正交实验设计根据单因素实验结果，以多糖提取率为考察指标，选取浸提温度、固液比、浸提时间和次数作为考察因素，各取3个水平，进行正交实验设计，优化马齿苋粗多糖的提取工艺条件，并对优化条件进行验证试验。1.2.4多糖含量测定［6］1.2.4.1标准曲线的制作精确称取105℃干燥至恒重的标准葡萄糖20mg，用100ml重蒸水定容。标准液稀释成质量浓度为30,60,90,120,150,180μg/ml的溶液，分别吸取稀释液0.6ml，加入50g/L苯酚1.2ml混合后迅速加入4ml浓硫酸，混合均匀后，30℃放置30min，在波长490nm处测定光密度，空白对照以重蒸水代替糖溶液。以糖浓度（C）为横坐标，光密度（D）为纵坐标，制作标准曲线。标准曲线线性回归方程为D＝0.0058C-0.0312，Ｒ＝0.9996，其中D为光密度，C为葡萄糖溶液浓度（μg/ml）。1.2.4.2原料中多糖含量的测定称取适量马齿苋于100℃、固液比1∶20、时间２ｈ条件下，提取5次，得到粗多糖。根据以上标准曲线计算多糖的浓度，再计算求得原料中多糖的质量和含量。根据标准曲线计算得到马齿苋原料中多糖含量为4.68%。1.2.4.3样品中多糖含量测定称取适量粗多糖样品，蒸馏水定容至10ml，精密吸取0.6ml按1.2.4.1中方法操作，测定光密度，根据标准曲线计算多糖的浓度，再计算求得样品中多糖的质量和含量。1.2.5多糖提取率的计算多糖提取率=粗多糖样品中多糖质量原料中多糖质量×100%1.2.6体外抗氧化试验——清除羟自由基活性试验利用H2O2和Fe2+混合发生Fenton反应，生成具有很高反应活性的·OH，在体系内加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质，该物质在510nm下有最大吸收。但若加入具有清除作用的物质，便会与水杨酸竞争，从而使有色产物生成量减少。本实验在Smironff等［7］报道的方法的基础上进行了改进，在试管中依次加入6mmol/LFeSO4溶液2ml、不同浓度粗多糖溶液2ml，6mmol/LH2O2溶液2ml，摇匀，静置10min，再加入6mmol/L水杨酸溶液2ml，摇匀，静置30min后于510nm处测得不同粗多糖浓度下的光密度Di；用水代替水杨酸时测得某浓度粗多糖的本底光密度Dj；用水代替抗氧化剂时测得空白对照光密度D0。清除率按下式计算:清除率S=1-Di-DjDo×100%2结果与分析2.1单因素试验2.1.1温度对多糖提取量的影响图1为在固液比1∶15、时间3h和提取1次条件下不同提取温度对马齿苋多糖提取质量的影响。可以看出多糖质量随温度升高而增加，90℃以后多糖质量增加很少。因此提取温度为90℃较为适宜。图1温度对多糖提取量的影响（略）Fig1Effectoftemperatureonpolysaccharidesweight2.1.2固液比对多糖提取量的影响图2为提取温度90℃、时间3h和提取1次条件下，不同固液比对马齿苋多糖提取质量的影响。结果表明，在固液比大于1∶15时，随着固液比的减小，多糖质量迅速增加，当固液比小于1∶15后，随着固液比的减少，多糖质量增加不多。由于浸提液在后续工艺中须经过浓缩步骤，初期加水量过大会使后续浓缩能耗增加，效率降低，因此在实际提取过程中固液比为1∶15较为合适。图2固液比对多糖提取量的影响（略）Fig22.1.3提取时间对多糖提取量的影响图3为提取温度90℃、固液比1∶15、提取1次条件下不同提取时间对马齿苋多糖提取质量的影响。结果表明，多糖质量随提取时间延长而增加，3h以后多糖质量增加较小。考虑到提取时间对能耗以及多糖结构稳定性的影响，实际提取时间为3h较合适。图3提取时间对多糖提取量的影响（略）Fig3Effectoftimeonpolysaccharidesweight2.1.4提取次数对多糖提取量的影响图4为提取温度90℃、固液比1∶15、提取时间3h条件下不同提取次数对马齿苋多糖提取质量的影响。可见，多糖质量随提取次数的增加而增加，提取3次后，多糖质量增加较小。因此实际提取次数为3次较合适。图4提取次数对多糖提取量的影响（略）Fig4Effectofextractiontimesonpolysaccharidesweight2.2正交试验和方差分析结果在单因素试验结果的基础上，以多糖提取率为考察指标，选定4个因素3个水平进行正交试验，因素水平见表1，正交试验结果见表2。表1多糖提取正交试验因素水平表（略）Tab1Factorsandlevelsoforthogonalofpolysaccharides′extraction（略）表2多糖提取正交试验结果（