骨形成蛋白微球温敏性凝胶复合系统的制备及释药特性研究

1骨形成蛋白微球温敏性凝胶复合系统的制备及释药特性研究符旭东1，刘宏，汤韧，张孟佑（广州军区武汉总医院药剂科，武汉，430070）摘要目的考察了处方和制备工艺对人重组骨形成蛋白－2（rhBMP-2）微球释放度的影响，并比较BMP微球和BMP微球温敏性凝胶复合系统的体外释药特性。方法采用W/O/W型乳化溶剂挥发法以聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）为材料制备空白微球，通过吸附法制备rhBMP-2载药微球。以单甲基聚乙二醇－羟基乙酸共聚物（MPEG-PLGA）为材料制备凝胶，采用夹心法酶联免疫吸附法测定释药速度。结果微球呈现三相释药模式，而微球凝胶剂体外释药曲线符合Higuchi方程。采用PLGA-COOH制备的rhBMP-2微球，其突释明显小于以PLGA为材料制备的微球，增加内水相与油相的体积比、在内水相中加入氯化钠均可以在一定程度上减小突释。结论BMP微球温敏性凝胶复合系统制备工艺，具有比rhBMP-2微球剂更理想的体外释药特性。关键词：人重组骨形成蛋白－2;聚乳酸-乙醇酸共聚物；单甲基聚乙二醇－羟基乙酸共聚物;微球；温敏性凝胶；突释Preparationofrecombinanthumanbonemorphogeneticprotein-2Loadedmicrospheres/thermosensitivehydrogelscomplexanditsinvitroreleasecharacteristicFuXu-dong,LiuHong，TangRen,ZhangMeng-you（WuhanGeneralHospitalofGuanzhouCommand,Wuhan430030,China）ABSTRACT：OBJECTIVEToexaminetheeffectsofformulationfactorsoninvitroreleaserateofrecombinanthumanbonemorphogeneticprotein-2(rhBMP-2)loadedmicrospheresandcomparedrugreleaseprofilesofmicrospheresandmicrospheres/thermosensitivehydrogelscomplex.METHODSBlankmicrosphereswerepreparedwithW/O/Wemulsionsolventevaporationmethod.RhBMP-2loadedmicrosphereswaspreparedwithabsorptionmethod.ThermosensitivehydrogelswerepreparedwithMPEG-PLGA.Enzyme-linkedimmunosorbentassaywasusedto1基金项目：湖北省科技攻关计划（2005AA301C38）通讯作者：符旭东，女，副主任药师Tel/Fax:[phone]E-mail:[e-mail]P-2microsphereswerecharacterizedbythreephase,whiletheinvitroreleaseprofileofrhBMP-2microspheres/thermosensitivehydrogelscomplexconformedtoHiguchiequation.TheamountofrhBMP-2releasedfrommicrospheresintheinitialburstphasewasdecresedmarkedlywhenPLGA-COOHwasusedtopreparemicrospheresinsteadofPLGA.IncreasingthevolumeratioofinternalaqueousandaddingNaCLtointernalaqueousphasecouldreduceinitialrelease.CONCLUSIONRhbmp2–loadedmicrospheres/thermosensitivehydrogelscomplexexertedadesirablereleasecharacteristic.KEYWORDSrecombinanthumanbonemorphogeneticprotein-2;PLGA;MPEG-PLGA;thermosensitivehydrogels;microsphere；initialburstrelease牙周病是世界卫生组织列为重点防治的、人类普遍罹患的口腔疾病之一，是成年人失牙的主要原因，其治疗的最终目标是实现牙周组织包括牙槽骨、牙骨质和牙周膜的完全功能性再生，而牙周组织再生的基础是牙周膜细胞（PDLCs），但在牙周损伤部位PDLCs的来源非常有限，以致牙周组织很难达到有效地再生和重建。骨形成蛋白（bonemorphogeneticprotein,BMP）是目前发现的唯一能在体内诱导骨与软骨的细胞因子，业已证实BMP能够促进PDLCs增殖及牙周组织的修复[1]，但是BMP在体内温度和酶的作用下非常容易代谢失活，限制了其发展和应用。寻找适宜的药物递送系统一直是BMP的研究热点之一，以生物可降解材料制备的微球或纳米粒制剂作为BMP牙周袋局部治疗的载体受到研究者的青睐，但是这种给药系统体外释药曲线并不是非常理想，表现出一定的突释或不规则的三相释药模式[2][3]，而且微粒制剂用于牙周袋局部给药还存在使用不便等缺点。笔者以聚乳酸-乙醇酸共聚物为材料制备BMP微球，通过处方和工艺的优化在一定程度上可降低突释；将制备的微球分散在以聚乙二醇单甲醚/聚乳酸-乙醇酸共聚物（MPEG-PLGA）为材料制备的凝胶中，BMP在微球凝胶复合系统中的释药速度得到进一步改善。MPEG-PLGA具有温敏性，一定浓度的MPEG-PLGA水溶液在室温下为自由流动的液态可以方便医生用药，在体温下可发生胶凝而起到控制药物释放的作用。本文主要报道了处方和制备工艺对BMP微球以及BMP微球凝胶剂体外释药曲线的影响。31材料和仪器骨形成蛋白（北京环亚泰克生物医学技术有限公司）；聚（乳酸－乙醇酸）共聚物50/50（PLGA，乳酸:乙醇酸比例为50:50，分子量为10000，山东省医疗器械研究所）；端羧基聚乳酸－羟基乙酸共聚物（PLGA-COOH,乳酸:羟基乙酸比例为50:50,分子量为10000，山东省医疗器械研究所），聚乙烯醇（PVA－124，日产进口分装，北京化学试剂公司）；MPEG-PLGA(LA:GA:EO的比例是8：2：1，分子量4000-5000，PEG分子量1000，济南岱罡生物技术有限公司)；BMP-2ELISA试剂盒（武汉博士德试剂公司）。数显式电动搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；JY9202D超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；SK－1快速混匀器（常州国华电器有限公司）；UV-260型紫外分光光度计（日本岛津公司）；SHZ－82恒温振荡器（常州国华电器有限公司）；BX-50光学显微镜（日本OLYMPUS公司）；S－450扫描电镜（日本HITACHI公司）；ALPHA1-4冷冻干燥机（CHRIST,德国）。2实验方法2.1BMP微球的制备空白微球采用W/0/W乳化溶剂挥发法制备，取适量水加入到2ml含有200mgPLGA的二氯甲烷中，冰浴条件下超声30s，然后将其倒入15ml3％的PVA溶液中，冰浴条件下600rpm搅拌10min后，将转速降至300rpm加入35ml水，在室温下继续搅拌4h，然后过滤，洗涤，真空五氧化二磷干燥48h。BMP微球通过吸附法载药，将10mg空白微球混悬在100µl含50µg·mL-1的BMP2.5％甘氨酸缓冲液中，4℃下吸附24h后冷冻干燥。2.2BMP微球凝胶的制备称取MPEG-PLGA4g置于20ml水中，搅拌后静置于4℃冰箱中，并时时振荡，待MPEG-PLGA充分溶胀后，即得20％MPEG-PLGA水凝胶。取10mg载药微球，加入2.5ml凝胶，在冰浴条件下充分混匀，即得含BMP2µg·mL-1的微球凝胶。2.3BMP微球及微球凝胶剂体外释放度的测定[4]将载有5µgBMP的微球分别混旋在2.5ml的0.1mol·L-1pH7.4的磷酸盐缓冲液、10％和20％的MPEG-PLGE水溶液中，精密量取0.1ml分别置于1ml的离4心管中，加入1mlpH7.4的磷酸盐缓冲液，置于恒温振荡器中，振荡速度为100r•min-1、温度为（37±1）℃，分别在0.5h、1、3、5、7、14、21和28d取样，2000rpm离心10min后，弃掉上清夜，沉淀物中加入1mlPBS，超声15min，2000rpm离心10min后，取上清液0.lml按1:10比例稀释后，采用夹心法酶联免疫吸附法测定样品中残留的药物，通过标准曲线计算BMP的含量，该方法的检测范围62.5－4000pg/ml，每份样品平行测定2次。释放度为释放前后系统中的药物含量之差与释放前系统的药物含量的百分比。2.4微球粒径及表面形态观察用光学显微镜及扫描电镜观察微球的外观形态，测定不少于200个的粒径，计算算术平均粒径。3结果与讨论3.1内水相与油相的体积比对BMP微球初始释药行为的影响以PLGA50/50为材料，考察当内水相与油相的体积比分别为1:5、1:10和1:20时微球的形态和释药行为。如图1所示，随着内水相与油相的体积比的增加，微球的粒径没有明显的变化（大约在20～30µm），但是微球表面的孔洞增加[5]，微球在0.5h～3d的释放度降低。这可能因为BMP是通过吸附作用载药的，随着内水相体积相对减少，微球内部和表面的孔洞减少（见图2），微球与BMP溶液接触面积减少，bmp被吸附的量减少，没有被吸附的BMP在释药初期很快扩散到释放介质，微球的突释增加。0204060800.52472t/h累积释放度/％内水相：油相1：5内水相：油相1：10内水相：油相1：20图1内水相与油相的体积比对BMP微球0～72h释药行为的影响5图2内水相与油相的体积比对BMP微球形态的影响内水相和油相的体积比A1:5B1:10C1:203.2内水相中氯化钠含量对BMP微球初始释药行为的影响将内水相与油相的体积比固定在1:5，用10％的氯化钠溶液替代水作为内水相，可以发现微球表面的孔洞明显增加（如图3所示），因为随着内水相渗透压增高，外相的水更容易进入微球的内部，表面的孔洞明显增加（见图4），和“3.1”项下观察到的结果相似微球在0.5h～3d的释放度显著降低。这可能同样是因为BMP是通过吸附载药，微球内部和表面的孔洞为BMP溶液的渗透提供了很多的通道，有利于药物的吸附。01020304050600.52472t/h累积释放度/％未加NaCL含10％氯化钠图3内水相中氯化钠含量对BMP微球0～72h释药行为的影响10µmA10µmB10µmC6图4内水相与油相的体积比对BMP微球形态的影响A内水相中未加氯化钠B内水相中含10％氯化钠3.3PLGA及PLGA-COOH对BMP微球释放度的影响如图5所示，采用PLGA-COOH制备的微球在0.5h～3d的释放度明显低于PLGA微球，这是因为BMP是一种碱性蛋白（等电点在9.0左右），可与PLGA-COOH分子链中的羧基可以发生离子相互作用而使BMP吸附量增加[6]，因此PLGA-COOH微球中未吸附的BMP减少，突释明显降低。01020304050600.52472t/h累积释放度/％PLGAPLGA-COOH图5PLGA种类对BMP微球0～72h释药行为的影响3.4MPEG-PLGA浓度对微球凝胶剂中BMP释放度的影响如图6所示，BMP微球表现出三相释药模式[7]：①0～1d的快速释放期。这是由于表面未吸附药物快速溶解所导致的，约有30％左右的药物释放；②第1d～5d