辣根过氧化物酶的提取纯化以及应用

辣根过氧化物酶的提取、纯化以及应用辣根过氧化物酶简介•辣根，是十字花科多年生直立草本植物，在世界大部分温和地区都有种植。它的根不但可以烹调，同时还含有一种含量丰富的过氧化物酶，这些同工酶统称为“辣根过氧化物酶(HRP)”。•其中含量最为丰富的是辣根过氧化物酶同工酶C(HRPC)•现在HRPC的结构与作用机制已经被阐明•结构•反应机理•分离纯化•特性分析•应用HRP的结构辣根过氧化物酶同工酶C是一条由308个氨基酸组成的肽链。在这条肽链中有4个由两分子半胱氨酸组成的二硫键,它们分别是11～91、44～49、97～301和17～209;同时还存在一个由Asp99和Arg123组成的盐桥。HRP的结构•HRPC含有两个不同的金属中心:正铁原卟啉(即血红素)和两个钙原子。这两个金属中心对酶的整体结构和功能都是非常重要的。•通过血红素中铁原子的一个轴向结合点与肽链上His170侧链的N原子结合,使血红素垂直连接在His170上(下图);而卟啉铁的另一个轴向结合点在静态酶中则是空着的,当有H2O2存在时,该结合点就能与CO、氰化物、氟化物或叠氮化物等小分子结合。HRPC的部分结构特征HRPC三维结构HRP的结构•酶的结构总体上看来大部分是α螺旋,但其中也包含一些小的β折叠。•在血红素平面上下两侧存在着两个空白区域,该区域可能是由钙结合位点与其他结构元素共同作用而成的,也可能是基因复制后留下的产物。HRP的结构•在血红素平面的上下两侧存在着两个钙原子的结合位点,它们通过一个氢键群与血红素结合区域相连。•每个钙原子都是7供氧配合体,它们能同时与主肽链上含羰基的氨基酸,侧链上的Asp、Ser和Thr,以及一个末端结构水分子结合。•钙离子的丢失将会导致HRPC酶失活和热稳定性的下降,还能使血红素的构型发生改变。HRP的作用机制•由HRP催化的多数反应可由以下等式表示：AH+H2O2→·A+2H2O•其中AH是还原性底物,·A是自由基。还原性底物包括芳香族化合物,酚类化合物,吲哚,胺类和磺酸盐。HRPC以阿魏酸为底物的催化循环•催化循环的第一步是H2O2和静态酶中的Fe(Ⅲ)反应生成化合物Ⅰ(HRPⅠ),HRPⅠ是一个高氧化态的催化中间体,包含一个含氧Fe(Ⅳ)中心和一个带正电荷的卟啉。•由一分子还原性底物的加入HRPⅠ,生成另一个含有含氧Fe(Ⅳ)中心的催化中间体HRPⅡ。•由一分子还原性底物参加HRPⅡ,使HRPⅡ还原成静态酶。•图中生成的两个带电子的产物可能会引起更复杂的反应,包括形成二倍体、三倍体、多聚体,以及启动一个以该产物为底物的反应。辣根过氧化物酶的分离纯化新鲜干净辣根匀浆尼龙纱布过滤上清40%-80%硫酸铵盐析沉淀用水溶解并在水中进行透析用-20℃丙酮制沉淀离心，取上清水溶解并透析辣根过氧化物酶的分离纯化梯度洗脱取第二个酶纯高峰部分在自来水中透析上样于CM-23纤维素上样于DEAE-52取酶活高峰部分浓缩，既得纯化辣根过氧化物酶梯度洗脱pH对HRP活力的影响•在不同的酸度条件下,分别测定辣根过氧化物酶(HRP)催化H2O2氧化OPD的初始反应速率(dA/dt),以dA/dt对pH值做图•发现,在pH值4.5～4.75范围内,HRP活力呈上升趋势,至pH值为4.75时HRP活力达到最大.以后随着pH值的增高,其活力呈下降的趋势.•HRP催化H2O2氧化OPD体系的最适pH为4.75.pH对辣根过氧化物酶活力的影响pH对溶液中HRP稳定性的影响pH对HRP稳定性的影响HRP分别在pH2.5～5溶液中保纯7天后,HRP催化反应速率为0,说明HRP在该条件下保纯7天后已完全失活.在pH6.0～8.0范围内,HRP催化反应的初始速率随pH值的增加而逐渐增大.当pH值达到8.0以后反应速率趋于稳定,说明HRP在偏碱性缓冲液中的稳定性较高,而在酸性条件下HRP容易失活,其原因可能是由于在碱性条件下酶的结构相对稳定,酶活性处于休眠状态辣根过氧化物酶应用•酚类化合物是常见的有毒有机污染物,含酚废水在我国水污染控制中被列为重点解决的有害废水之一,它的大量排放对水体、土壤造成严重的污染,进而危害人类的健康。•HRP在H2O2存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。•张国平等人对用辣根过氧化物酶处理废水中的五氯酚进行了研究pH值对去除率的影响在pH=2～8的范围内测定了五氯酚在辣根过氧化物酶和H2O2的作用下的去除率。实验结果见左图。由图可见,在pH值为4和5时,去除率达95%以上,为最佳pH范围。pH值对去除率的影响H2O2对去除率的影响•采用不同的H2O2用量与0.05mmol/L五氯酚进行实验(辣根过氧化物酶是过量的),测定五氯酚的去除率,结果见左图。当H2O2用量为0～0.025mmol/L时,五氯酚去除率按比例上升(也即残余五氯酚浓度按比例下降),表明H2O2与PCP有着固定的反应计量比。当H2O2达到0.025mmol/L以上时,去除率已达最高,说明这时H2O2用量已饱和。H2O2对去除率的影响不同条件下的去除速率•总的来说,反应是相当快的,所有的反应都在15min内进行了一半以上。•当H2O2/PCP相同时,酶用量多,则反应速度快。对于H2O2/PCP=0.5的2个反应,酶用量为0.1U/mL时只用15min就获得了80%以上的去除率,而酶用量为0.05U/mL时则用了40min。•当酶用量相同(同为0.1U/mL)时,H2O2/PCP=1时的去除速度比H2O2/PCR=0.5时要快,前者只用8min就获得了80%以上的去除率,而后者则用了15min。•适度增加H2O2可以加快反应,太过量的H2O2也会对反应有抑制作用不同条件下的去除速率其他应用•辣根过氧化物酶是临床检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。•HRP作为一种标志酶以观测蛋白质和生物膜表面的探针,高质量的HRP还应用于分子生物学如蛋白质印迹等。•但是，目前HRP尚不能用基因工程生产。谢谢大家HRP的CM-23洗脱图HRP的DE-52洗脱图