过氧化氢刺激人牙髓干细胞的衰老进程

中国组织工程研究第20卷第10期2016–03–04出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchMarch4,2016Vol.20,No.10ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH1481·研究原著·徐克，男，1982年生，江苏省南通市人，汉族，2006年南通大学毕业，主治医师，主要从事口腔颌面外科及牙髓干细胞生物学特性方面的研究。通讯作者：冯桂娟，医师，硕士，南通大学附属医院口腔科，江苏省南通市226001中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)10-01481-07稿件接受：2016-01-24，冯桂娟2，冯兴梅2，黄丹2，郑科2，唐恩溢1(1南京大学医学院，江苏省南京市210093；2南通大学附属医院口腔科，江苏省南通市226001)引用本文：徐克，冯桂娟，冯兴梅，黄丹，郑科，唐恩溢.过氧化氢刺激人牙髓干细胞的衰老进程[J].中国组织工程研究，2016，20(10):1481-1487.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.016ORCID:0000-0002-2872-1905(冯桂娟)文章快速阅读：文题释义：牙髓干细胞：2000年，Gronthos等人利用酶消化的方法，从人第三磨牙中分离出比骨髓基质干细胞具有更高克隆能力和增殖能力的牙髓干细胞。牙髓干细胞的鉴别主要依赖于它的生物学特性，包括细胞体积小、集落生成能力、高增殖能力、自我更新能力和多潜能分化能力。细胞衰老：指由DNA损伤、氧化应激、基因表达紊乱和其他有害刺激导致的不可逆的细胞生长停滞，它包含了细胞增殖及功能的改变，细胞的衰老促进了机体的老化和相关疾病的发生。研究发现调节细胞衰老的机制有多种假说，例如端粒酶学说、DNA损伤学说、氧化应激学说等。摘要背景：细胞移植治疗受区存在氧化应激过程，影响疗效。研究氧化应激对牙髓干细胞的影响及机制方面的报道较少。目的：分离培养人牙髓干细胞，分析加入过氧化氢(H2O2)对其衰老程度的影响。方法：牙髓干细胞分为3组，分别用PBS、100μmol/LH2O2、200μmol/LH2O2刺激2h。倒置显微镜下观察细胞形态，β-半乳糖苷酶染色观察细胞衰老程度，BrdU试剂盒和细胞计数法检测细胞增殖能力，免疫荧光检测细胞骨架排列情况和sirt1蛋白的表达，WesternBlot法测定sirt1、p16蛋白的表达。结果与结论：①牙髓干细胞呈成纤维细胞样梭形外观。②H2O2刺激后，细胞体积增大、β-半乳糖苷酶染色加深、细胞增殖能力降低，随着H2O2浓度增加，牙髓干细胞衰老增强，在此过程中，p16表达上调，sirt1表达受到抑制。③结果表明H2O2刺激促进牙髓干细胞衰老，sirt1、p16参与了此过程，为牙髓干细胞移植提供了理论基础和实验支持。关键词：干细胞；培养；牙髓干细胞；过氧化氢；衰老；p16；sirt1；国家自然科学基金主题词：牙髓；干细胞；过氧化氢；细胞衰老；组织工程基金资助：国家自然科学基金青年基金项目(81500809)过氧化氢刺激影响人牙髓干细胞的衰老进程0，100，200μmol/L过氧化氢刺激细胞骨架细胞形态β-半乳糖苷酶活性细胞增殖衰老相关蛋白细胞体积增大，变扁平β-半乳糖苷酶活性增加细胞增殖能力降低细胞骨架排列紊乱p16表达上调，sirt1表达受到抑制牙髓干细胞徐克，等.过氧化氢刺激人牙髓干细胞的衰老进程P.O.Box10002,Shenyang110180:FengGui-juan,Master,Physician,DepartmentofStomatology,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,JiangsuProvince,ChinaHydrogenperoxideacceleratessenescenceofhumandentalpulpstemcellsXuKe1,FengGui-juan2,FengXing-mei2,HuangDan2,ZhengKe2,TangEn-yi1(1MedicalSchoolofNanjingUniversity,Nanjing210093,JiangsuProvince,China;2DepartmentofStomatology,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,JiangsuProvince,China)AbstractBACKGROUND:Theprocessofoxidativestressthatimpactsthecurativeeffectexistsintheregionwhichacceptscelltransplantation.However,therearefewreportsabouttheeffectsofoxidativestressonhumandentalpulpstemcellsandrelevantmechanism.OBJECTIVE:Tounderstandtheeffectofhydrogenperoxideonthesenescenceofhumandentalpulpstemcells.METHODS:HumandentalpulpstemcellswereisolatedandculturedinPBS,100and200μmol/Lhydrogenperoxidefor2hours,respectively.Cellmorphologywasobservedunderinvertedmicroscope,degreeofcellsenescencemonitoredbyβ-galactosidasestaining,cellproliferationabilitydetectedbyBrdUkitandcellcountingmethod,cytoskeletonofdentalpulpstemcellsandexpressionofsirt1testedusingimmunofluorescencemethod,andexpressionofsirt1andp16proteinsmeasuredbywesternblotassay.RESULTSANDCONCLUSION:Dentalpulpstemcellsexhibitedafibroblast-likemorphologywithspindle-shapedappearance.Afterstimulatedbyhydrogenperoxide,thecellvolumewasenlarged,theβ-galactosidasestainingdeepenedandtheproliferationofdentalpulpstemcellsreduced.Theenhancementofsenescenceofdentalpulpstemcellswasaccompaniedwiththeincreasingconcentrationofhydrogenperoxide,andinthisprocess,theexpressionofp16wasraisedwhiletheexpressionofsirt1wasdecreased.Inconclusion,thesenescenceofhumandentalpulpstemcellscanbepromotedbythestimulationofhydrogenperoxide,andsirt1andp16areinvolvedinthisprocess.Ourfindingsmayprovideatheoreticalandexperimentalfoundationforautologoustransplantationofdentalpulpstemcells.Subjectheadings:DentalPulp;StemCells;HydrogenPeroxide;CellAging;TissueEngineeringFunding:theNationalNaturalScienceFoundationofChina,No.81500809Citethisarticle:XuK,FengGJ,FengXM,HuangD,ZhengK,TangEY.Hydrogenperoxideacceleratessenescenceofhumandentalpulpstemcells.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(10):1481-1487.0引言Introduction牙髓是间充质干细胞最理想的来源之一。2000年，Gronthos等[1]利用酶消化法，从人第三磨牙中分离出比骨髓基质干细胞具有更高克隆能力和增殖能力的干细胞，并将其命名为牙髓干细胞。牙髓干细胞显示多潜能分化能力，可以分化为各种细胞，如成骨细胞、成牙本质细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、神经细胞和成肌细胞等[2-5]。牙髓干细胞很容易被分离、培养，且具有低免疫原性，是理想的种子细胞[3，6-7]。骨缺损等部位存在缺血、缺氧、炎细胞浸润等因素[8]，产生大量活性氧，出现氧化应激状态，损害细胞活性，影响牙髓干细胞移植效果[9]。过氧化氢(hydrogenperoxide，H2O2)是活性氧簇的主要成员之一，可通过多种途径损害细胞[10-12]。既往研究显示H2O2可以诱导间充质干细胞衰老[13-17]，研究氧化应激对牙髓干细胞的影响及机制，有利于提高细胞移植的疗效。实验采用不同浓度H2O2处理牙髓干细胞，观察H2O2诱导应激性衰老细胞形态、β-半乳糖苷酶活性、细胞增殖能力、细胞骨架变化及其作用机制，为优化牙髓干细胞移植治疗疾病提供理论依据和实验基础。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计细胞学体外观察实验。1.2时间及地点实验于2015年10至12月在南通大学附属医院完成。1.3材料过氧化氢刺激人牙髓干细胞衰老实验所用主要试剂与仪器：试剂及仪器来源DMEM培养基、胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素美国HyClone公司3g/LⅠ型胶原酶、4g/L分散酶美国Sigma公司β-半乳糖苷酶试剂盒碧云天公司BrdU试剂盒上海酶联生物科技有限公司H2O2美国SantaCruz公司F-actin武汉艾美捷科技有限公司兔抗GAPDH抗体、兔抗人p16抗体、兔抗人sirt1抗体、鼠抗兔生物素化二抗美国SantaCruz公司荧光显微镜德国Leica公司徐克，等.过氧化氢刺激人牙髓干细胞的衰老进程ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH1483牙髓干细胞分离、培养、鉴定选择正畸减数拔除的健康牙齿标本，告知患者拔除的牙齿将用于提取牙髓干细胞，得到所有患者知情同意，并签署《南通大学附属医院知情同意书》。在超净台上用碘伏冲洗正畸减数拔除的健康牙齿，再用无菌生理盐水冲洗至无血迹，用咬骨钳沿釉牙骨质界打开髓腔，镊子取出牙髓，剪去根部的牙髓组织。将3g/LⅠ型胶原酶与4g/L分散酶以1︰1比例混合，两种酶以1︰10的体积与剪碎的牙髓混合消化1h，消化后的组织经1000r/min离心5min，弃上清液，加完全培养液(体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素