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近代生物学技术复习归纳一、质粒的结合转移1.二亲本杂交：供体菌中有完整的RP4片段，无需辅助菌，可直接转入受体菌中。2.三亲本杂交：供体菌中无RP4，需要含有tra基因的辅助菌，诱动质粒中的oriT片段，才能使质粒转移到受体菌。3.电转化细胞学原理：细胞处于电场中时，细胞膜起着电容器的作用。电流不能通过，当电压升高，细胞膜组分被极化，并在两边形成电位差。当电位差达到某一临界值，细胞膜局部被击穿，形成一些瞬时的孔洞，孔径大小足以让大分子物质（如质粒DNA）进出细胞。只要电场强度和脉冲时间不超过临界限度，这种通透性就是可逆的。二、His-tag融合蛋白的亲和纯化1.在目标蛋白的N端和C端添加特殊序列的目的：提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的亲和纯化，实现目标蛋白的表达定位…2.组氨酸标签（His-tag）：连续的6个His融合于目标蛋白的N端或C端，通过His与金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+、Ni2+的螯合作用而实现亲和纯化；His标签具有较小的分子量，一般不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。3.镍离子亲和层析柱纯化His-tag蛋白主要操作流程：1.菌体培养及蛋白诱导；2.层析柱的预处理；3.天然条件下的细胞破碎，收集蛋白；4.上柱吸附，漂洗后洗脱；5.对纯化收集的各组分蛋白进行SDS-PAGE凝胶检测。三、宏基因组及显微技术1.宏基因组学⑴环境宏基因组定义：不依赖于培养物的微生物群落基因组分析或环境微生物菌群的混合基因组分析。⑵宏蛋白组学：大规模鉴定在一个特定的时间，微生物菌群产生的整个蛋白质。确定样品中微生物的种类：收集样品——提取DNA——构建16SrRNA文库——测序分析。⑶构建宏基因组文库的过程：收集样品——提取DNA——酶切——与载体连接——转化——筛选转化子——确定基因。之后对文库中的DNA进行序列分析(测序，生物信息学分析，其他分析)和具有特定表型的功能筛选。⑷基于活性(功能)的筛选：确定具有所需要表型的克隆——对选定的克隆进行序列分析和生化分析——对有用活性快速测定——功能所需要的所有基因都在一个克隆并在宿主细胞内达。优点：能产生全新的基因或化合物；缺点：频率低下，工作量大。⑸基于序列分析的筛选：利用保守序列设计PCR引物或探针筛选整个宏基因组文库以获得我们所感兴趣的克隆。优点：不依赖于基因的表达；缺点：选择性不好。⑹功能基因的筛选策略：①探索构建新的载体、扩大宿主范围等提高宏基因的表达水平；②通过富集特定类群的基因组提高目标基因在文库中的频率，如在拟采样环境中添加稳定同位素13C标记底物，与底物降解有关的微生物代谢活跃，13C就进入到其基因组中，提取带13C标记DNA片段建库则可以获得较多的相关底物降解活性克隆；③开发DNA芯片和蛋白质芯片提高筛选频率；④随着技术的不断进步，宏基因组克隆必将成为微生物活性物质筛选的重要手段并发挥巨大作用。2.相差显微镜①相差显微镜（phasecontrastmicroscope）：一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特种显微镜。②由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。③原理：相差显微镜与普通显微镜主要不同之处在于用环状光栏代替可变光栏，用带相板(phaseplate)的物镜(通常用“ph”标志)代替普通物镜，并带有一个合轴调中望远镜及滤色片。这些特殊装置能使活细胞或末经染色的标本中各部分的折射率或厚度的微小差异，产生相位差，然后利用光的衍射和干涉的原理，把相差变成振幅(明暗)之差，使人的肉眼能够辨认出来。④应用：相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及细微结构的观察。因此，是微生物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生物学研究的必备工具。⑤使用方法：1.依次将物镜换为相差物镜，聚光器换为相聚光器，并升至最高位置，并在视场光阑处加上黄绿色滤光片。2.将活体标本放在镜台上，把相聚光器调至10处，用10×相差物镜观察并调节至物像清晰。3.将目镜换成合轴调整望远镜，把上透镜适当旋出并调节使相板上的亮环与暗环准确聚焦。4.调节相聚光器两侧的调节旋钮（或插入式调节杆），使亮环准确的与暗环重合。5.将合轴调整望远镜重新换为目镜进行低倍镜观察，并将物像调至视野中部。6.依次按3.2－3.5的步骤进行20×，40×物镜和100×油镜观察。7.注意事项：a.一定要将聚光器升至最高位置。b.相差物镜与相聚光器一定要匹配，否则无法使亮环与暗环重合。c.视野亮度应随物镜倍数升高而加大。3.稳定性同位素探针技术（SIP）将原位或微宇宙(microcosm)的环境样品暴露于稳定性同位素富集的基质中,这些样品中存在的某些微生物能够以基质中的稳定性同位素为碳源或氮源进行物质代谢并满足其自身生长需要,基质中的稳定性同位素被吸收同化进入微生物体内,参与某些特定物质如核酸(DNA和RNA)及磷脂脂肪酸(PLFA)等的合成,通过提取、分离、纯化、分析这些微生物体内稳定性同位素标记的生物标志物,从而将微生物的组成与其功能联系起来。四、酵母双杂交技术1.原理：真核生物的转录激活因子都是由两个或两个以上功能上相对独立的结构域所组成的，其中有DNA结合结构域（DBD）和转录激活结构域(AD)，这两个结构域是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的BD可以和基因的上游激活序列（UAS）结合，但不能激活基因的转录；单独的AD由于不能接近启动子，也不能激活转录。应用DNA重组技术把BD和AD从形体上分开，并共转化到同一细胞中，由于产生的BD和AD多肽彼此之间不会直接发生相互作用，因此不能激活相关基因的转录。只有当两个分别融合在BD和AD上的蛋白相互作用时，才将BD和AD结构域联接在一起，才具有转录激活作用。根据下游报告基因表达予否，可鉴定两个蛋白是否相互作用。2.应用：（1）检测已知蛋白间的相互作用；（2）确定蛋白质相互作用的活性位点；（3）鉴定与已知蛋白能相互作用的靶蛋白；（4）鉴定激素对受体蛋白相互作用的影响；（5）蛋白质相互作用图谱的绘制。3.特点：(1)有很高的灵敏性，可以检测到生物化学方法检测不到的相对较弱及暂时的蛋白质间的相互作用；(2)酵母双杂交系统是直接在细胞内表达融合蛋白，减少了人工纯化蛋白质的繁琐步骤；(3)酵母双杂交系统是在活细胞内进行，蛋白质相对于体外更可能处于天然状态，因此更能代表细胞内的真实情况；(4)融合载体可以进行各种修饰以利于后续工作中确认蛋白质间的相互作用。如BD和AD载体各自带上不同的表面抗原标记以方便地用这些抗原的抗体来鉴定蛋白质。4.常见问题：（1）假阳性较多：通过双杂交观察到的蛋白质相互作用，在真实情况下不一定发生，也即所谓的假阳性。（2）转化效率较低：酵母的转化效率比细菌低4个数量级，而在该系统中一般要进行两个或两个以上的质粒的转化，这需要大量转化子，使得该系统的工作量巨大。（3）阴性干扰：两个蛋白本该发生相互作用，但报告基因不表达或表达量很低以至检测不出。5.解决方法：（1）作严格的对照实验。对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。采用多个报告基因。如同时使用lacZ和HIS3报告基因，可大量降低假阳性率。（2）将报告基因整合到染色体上，可使表达水平稳定，消除由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。（3）对于转化率低的问题，Bendixen等人（1994）通过酵母结合型的引进，避免了两次转化操作，同时又提高了双杂交效率。（4）得到阳性克隆后，要进一步做诱饵蛋白与潜在阳性克隆间的免疫共沉淀分析，以证实这样的蛋白间相互作用可在天然细胞中发生。五、荧光定量PCR1.概念：定量PCR指估算样本中的原始模板数。它是通过一定循环次数的PCR的扩增后的PCR产物量来判断样品的原始模板数。2.原理：定量PCR是以PCR扩增为基础的，定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。如果用N0代表PCR反应中的原始模板数，n为扩增次数，那么扩增产物的初期直线增长：而经过一定循环次数扩增后，进入平台期。定量PCR就是在指数增长期实现对原始摸板定量的（在指数增长期内N=N0(1+e)n，如果知道扩增的产物量N及PCR扩增的效率e，便可知道原始模板N0值）。3.相对标准曲线法：所谓的实时荧光定量PCR，其反应体系中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。一般而言，荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值。定量荧光扩增曲线是荧光量与循环数的图表。荧光阈值线的位置一般事实上位于减去本底的位置上，这时的荧光信号超过了荧光背景信号并且开始增加。对某一样品的C(t)值就定义为荧光量与荧光阈值线交叉时的循环数。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表CT值，纵坐标代表起始拷贝数的对数。因些只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。磊峰7月5日