演示文稿1基因工程的基本操作程序

基因工程转基因生物基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。什么是基因工程？练习：基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定1.1DNA重组技术的基本工具准确切割DNA的工具（“分子手术刀”）——限制性内切酶DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）——DNA连接酶基因转移工具（“分子运输车”）——运载体概述：切割DNA的工具是限制性核酸内切酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。现在已分离出约4000种限制酶。限制酶能识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”特点：限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且在特定的位点切割DNA分子。（专一性）例如：大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。黏性末端黏性末端回文序列如何切割DNA分子呢？DNA分子磷酸二酯键切割DNA分子实质是断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键。一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”思考：（1）在一个DNA分子片段中，含有个游离的磷酸基团，如果是环状DNA分子呢？切割DNA分子后形成什么呢？产物：黏性末端（在中轴线两侧切割DNA）平末端（在中轴线处切割DNA）一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”小结：（1）限制酶的种类、分布、特点、作用部位、作用结果；（2）练习1.酶的种类：二、DNA连接酶—“分子缝合针”（1）E·coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来。（2）T4DNA连接酶（噬菌体）两种酶的区别：（1）E·coliDNA连接酶（大肠杆菌）（2）T4DNA连接酶都能连接黏性末端和平末端，但连接平末端之间的效率比较低。2.酶的作用：将双链DNA分子片段“缝合”起来，恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键。二、DNA连接酶—“分子缝合针”思考：比较(考点一)限制性内切酶与DNA连接酶跟踪演练：AATTGCCTTAAG磷酸二酯键磷酸二酯键DNA复制思考：比较DNA连接酶和DNA聚酶？DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的单链核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键,需要摸板。DNA连接酶是连接两个双链DNA片段的末端，形成磷酸二酯键,不需要摸板。要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。常用的载体是质粒，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”作为基因工程运载体的条件①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。②具多种限制酶切点，以便与外源基因连接。③具有某些标记基因，便于进行筛选。④载体是安全的，不能对受体细胞有害。⑤载体DNA分子大小应合适，以便提取和在体外进行操作。。•（2009高考-理综山东）35.人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体。已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原，且疾苗生产和抗体制备的流程之一如下图：四、典型例题解读——基因工程与细胞工程•请回答：•（1）过程①代表的是。•（2）过程②构建A基因表过载体时，必须使用•和两种工具酶。•（3）过程③采用的实验技术是，获得的X是。•（4）对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的所制备的疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，可以疑似患者体内分离病毒，与已知病毒进行比较；或用图中的进行特异性结合检测。•参考答案：•（1）逆转录•（2）限制性核酸内切酶（限制酶\限制性内切酶）DNA连接酶（两空可以互换）•（3）细胞融合杂交瘤细胞•（4）A蛋白核酸（基因）序列抗A蛋白的单克隆抗体合成基因组织、器官、细胞基因组DNAcDNA文库基因文库目的基因的克隆基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取如何建立?基因组DNA文库与cDNA文库的比较②基因文库的构建a.直接分离法:②基因文库的构建a.直接分离法:②基因文库的构建a.直接分离法:基因组文库的构建②基因文库的构建a.直接分离法:基因组文库的构建②基因文库的构建a.直接分离法:基因组文库的构建b.反转录法：②基因文库的构建a.直接分离法:基因组文库的构建b.反转录法：mRNAcDNA(互补DNA)双链DNA反转录DNA聚合酶②基因文库的构建a.直接分离法:基因组文库的构建b.反转录法：mRNAcDNA(互补DNA)双链DNA反转录DNA聚合酶cDNA文库的构建②基因文库的构建a.直接分离法:基因组文库的构建b.反转录法：解读cDNA文库的构建过程(1)提取某种生物发育某一时期的mRNA;(2)mRNA反转录形成DNA片段;(3)DNA片段与载体连接后,储存在一个受体菌的群体中。文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子(具有启动作用的DNA片段)无有基因中内含子(位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段)无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以cDNA文库和基因组文库的区别DNA复制PCR技术基因克隆场所细胞核或细胞器生物体外细胞内酶解旋酶、DNA聚合酶耐高温DNA聚合酶限制酶、连接酶载体不需要不需要需要遵循原则碱基互配对碱基互配对碱基互配对结果形成DNA分子形成DNA分子片段形成DNA分子片段DNA复制、PCR技术与基因克隆的比较三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因目的基因转移转化或感染合成基因组织、器官、细胞基因组DNAcDNA文库基因文库目的基因的克隆基因工程的基本操作程序第二步：基因表达载体构建（二）基因表达载体的构建——核心（二）基因表达载体的构建——核心1.作用（二）基因表达载体的构建——核心1.作用（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代（二）基因表达载体的构建——核心1.作用（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代（2）同时使目的基因能表达和发挥作用（二）基因表达载体的构建——核心1.作用（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代（2）同时使目的基因能表达和发挥作用2.组成（二）基因表达载体的构建——核心1.作用（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代（2）同时使目的基因能表达和发挥作用2.组成（二）基因表达载体的构建——核心1.作用（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代（2）同时使目的基因能表达和发挥作用2.组成目的基因启动子终止子标记基因（二）基因表达载体的构建——核心3.构建过程（二）基因表达载体的构建——核心3.构建过程①用一定的________切割质粒，使其出现一个切口，露出_________。②用____________切断目的基因，使其产生_________________。③将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量____________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）（二）基因表达载体的构建——核心3.构建过程①用一定的________切割质粒，使其出现一个切口，露出_________。②用____________切断目的基因，使其产生_________________。③将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量____________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端（二）基因表达载体的构建——核心3.构建过程①用一定的________切割质粒，使其出现一个切口，露出_________。②用____________切断目的基因，使其产生_________________。③将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量____________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端（二）基因表达载体的构建——核心3.构建过程①用一定的________切割质粒，使其出现一个切口，露出_________。②用____________切断目的基因，使其产生_________________。③将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量____________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口DNA连接酶人胰岛素基因与质粒结合形成重组质粒质粒DNA分子一种限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子(重组质粒)你知道双酶切法吗？例1（10年江苏高考）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止___________________。×√√√原核细胞表达真核细胞表达植物中表达动物中表达人体表达发酵工程转基因植物动物器官发生器转基因动物基因治疗目的基因转移转化或感染合成基因组织、器官、细胞基因组DNAcDNA文库基因文库目的基因的克隆基因工程的基本操作程序第三步：将目的基因导入受体细胞第四步：目的基因的检测与鉴定3、将目的基因导入受体细胞•方法：•将目的基因导入植物细胞：•农杆菌转化法（双子叶植物和祼子植物）、基因枪法（单子叶植物）、花粉管通道法•将目的基因导入动物细胞•显微注射法•将目的基因导入微生物细胞•感受态细胞将目的基因导入植物细胞•农杆菌转化法类型步骤检测内容方法结果显示分子水平检测第一步目的基因是否插入受体细胞DNADNA分子杂交是否显示杂交带第二步目的基因是否转录出mRNADNA与mRNA分子杂交是否显示杂交带第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交是否显示杂交带个体水平鉴定包括做抗虫，抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能是否相同。4.目的基因的检测与鉴定4、目的基因的检测与鉴定•鉴定：（个体水平）•抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等4、目的基因的检测与鉴定•将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物1、例22、课时作业：1、2、3、6、7、8、9、10、11思考：跟踪演练2四、典型例题解读——基因工程操作过程训练2(2010·天津卷，7Ⅰ)Ⅰ.下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ直线所示为三种限制酶的酶切位点。据图回答：(1)图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含的培养基上进行。(2)能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是(填字母代号)。A．启动子B．tetRC．复制原点D．ampR(3)过程①可采用的操作方法是________(填字母代号)。A．农杆菌转化B．大肠杆菌转化C．显微注射D．细胞整合(4)过程②采用的生物技术是________。(5)对早期胚胎进行切割，经过程②可获得多个新个体。这利用了细胞的________性。(6)为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用___(填字母代号)技术。A．核酸分子杂交B．基因序列分析C．抗原－抗体杂交D．PCR解析(1)基因表达载体的构建过程中，将目的基因导入受体细胞之前，要用同一种限制酶切割目的基因和载体。从图中可以看出，在目的基因和载体中都有HindⅢ和BamHⅠ限制酶的切割位点，因此要用Hind