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广安市中心血站文件编号：GAX/SOP-J-01操作规程版本/修订：2011/C/0标题：雅培试剂抗-HCV检测操作规程页码：共页第页1、目的为了规范雅培丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒的检测工作，保证血液检测结果的准确性、正确性和可靠性，保障血液质量，根据《》制定本操作规程。2、职责血液检测岗位人员负责献血者血液标本丙型肝炎病毒抗体的检测。3、适用范围适用于献血者血液标本丙型肝炎病毒抗体的检测。4、原理在Murex抗-HCV4.0试剂中，稀释后的样品与包被在微孔板上的超纯度的核心。NS3，NS4，NS5抗原一起孵育，样品中的抗-HCV抗体与包被抗原结合。通过洗涤去除未结合的物质，被捕捉的抗体和过氧化物酶标的抗人IgG单克隆抗体孵育形成抗原-抗体-酶结合物，通过洗涤去除多余的酶结合物后，加入底物TMB和过氧化氢显色，当样品中有抗-HCV抗体存在，颜色呈紫色。加入硫酸终止酶反应，应用酶标仪测吸光值，样品中的浓度与颜色深浅有直接关系。5、标本要求5.1血液标本容器和添加（抗凝）剂分离胶试管或不抗凝试管5.25ml静脉血离心分离后的血清或血浆（血辫）。6、所需仪器设备广安市中心血站文件编号：GAX/SOP-J-01操作规程版本/修订：2011/C/0标题：雅培试剂抗-HCV检测操作规程页码：共页第页微量振荡器、可调微量移液器、电热恒温水浴箱、离心机、全自动酶免检测系统（STARLET前处理和FAME16/20后处理）、MUTISKANMK3酶标仪、汇松洗板机、定时器。7、试剂材料7.1一次性移液器（与微量加样器配套），一次性加样尖（与STARLET配套）、量筒、蒸馏水。7.2贴有本站质量管理科“质检合格”标签的由MurexBiotechS.A.(PTY)Ltd.生产的丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒（ELISA）。康彻思坦生物或卫生部临床检验中心提供的弱阳性质控血清。8、检测环境要求温度18-25℃，湿度30%-70%。9、步骤与方法9.1实验前的准备9.1.1环境确认观察实验室环境温度、湿度是否在要求范围内，如不在范围应使用空调、加湿器等设备使检测环境条件符合要求。9.1.2仪器设备的准备对本次检测需用的设备MUTISKANMK3酶标仪、汇松洗板机、微量振荡器、可调微量移液器运行状态和37℃水浴箱的温度及环境温湿度进行确认，按《MUTISKANMK3酶标仪操作规程》和试剂盒说明书编制结果判读程序（如酶标仪中贮存有相应的程序可直接调用）。按《汇松PW-960洗板机操作规程》和试剂盒说明书编制编制洗板程序（如洗板机中贮存有相应的程序可直接调用）。如使用全自动酶免分析系统进行实验，应进行仪器初始化。详见《FAME16/20操作规程》及《全自动酶免分析系统实验操作规程》广安市中心血站文件编号：GAX/SOP-J-01操作规程版本/修订：2011/C/0标题：雅培试剂抗-HCV检测操作规程页码：共页第页9.1.3试剂的准备（1）从冰箱中取出雅培丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒和抗-HCV标准物质（质控血清）。对标准物质(质控血清)的含量、批号、有效期、外观、容量和开始使用日期等是否符合要求等内容进行确认；如标准物质(质控血清)为冰冻保存的，应待其完全溶化。（2）对丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒应检查的外包装，字迹是否清晰、内容是否齐全、是否有质量管理科抽检并贴有“质检合格”标签，是否在有效期内、试剂盒内组分是否齐全、液体组分是否澄清均匀无异物、是否无溢液及渗漏等。（3）将试剂盒于室温放置30分钟以上，使其温度平衡到室温，并充分混匀各试剂。（4）如果使用自动加样器和酶免后处理进行实验，进行如下操作：将试剂槽和阴阳性对照，以及质控品载架从冰箱中取出，放置平衡至室温，检查试剂槽内液体和阴阳性对照，以及质控品等是否对应载架上的相应位置，是否足量，是否在一周之内开启，质控品是否变质，是否混浊，新开启的质控品应标明时间。如果不足应将试剂倒入相应仪器试剂槽中。试剂倒入前应检查试剂瓶标识和仪器试剂槽标识，防止试剂错误倒入。（5）将浓缩洗液用蒸馏水按20倍比例稀释，按实际需要，配制适量的工作洗液。浓缩洗液使用前检查是否有结晶出现，若出现结晶，应置于37℃至溶解后再使用。如使用酶免后处理器进行实验，进行如下操作：将配好的洗液倒入相应的仪器洗液瓶中，洗液倒入前应检查原洗液瓶标识和仪器洗液瓶标识，防止倒入错误，然后将洗液瓶置于酶免后处理器洗板架上待用。9.1.4实验微板的准备（1）经平衡后，从密封袋中取出微板后，检查酶免板板底是否无划痕、平整，用手轻压微板检查，使之平整；并且检查微板孔内有无异物。广安市中心血站文件编号：GAX/SOP-J-01操作规程版本/修订：2011/C/0标题：雅培试剂抗-HCV检测操作规程页码：共页第页（2）计算所需的孔数。每板3孔阴性对照，2孔阳性对照，1孔质控。加样示意见图1.根据检测标本数量及对照孔数量，把需用的微孔板条拼组于微孔板架上，微孔板条必须平放于微孔板架上，各微孔在同一水平高度，避免高低不平。（3）如使用全自动酶免分析系统，应在余板空位上用清洁的废旧板条补满板，补齐后应用手轻压微板检查，使之平整。再放置于仪器相应位置执行《STARLET的使用和维护保养操作规程》及《全自动酶免分析系统实验操作规程》？。9.1.5标本的准备将离心处理后的标本放置在标本槽内，标本需要插入标本槽底部，献血条码面对着标本槽缺口处，如手工检测应将标本编流水号，放入试管架上。9.2实验操作（全自动检测见《STARLET的使用和维护保养操作规程》和《FAME16/20操作规程》及《全自动酶免分析系统实验操作规程》？）9.2.1加样（手工或STARLET加样器）：（1）每反应孔加入180ul样品稀释液（2）按图1规定的位置分别加入待检血样、阴阳性对照品、弱阳性质控血清各20ul。阴、阳性对照、质控血清在待检血样加完后再依次加入。其中H1孔和未使用的余孔可根据具体情况需要加入重验标本、质控血清或其他标本，加样完毕后，必须确认标本、对照品、质控血清加注完全、位置正确，并振荡混匀（振荡时不要让液体溅出）。手工操作时应确保加样时吸嘴未接触微孔的底部和边缘。123456789101112ANCSM1SM9SM17SM25SM33SM41SM49SM57SM65SM73SM81BNCSM2SM10SM18SM26SM34SM42SM50SM58SM66SM74SM82广安市中心血站文件编号：GAX/SOP-J-01操作规程版本/修订：2011/C/0标题：雅培试剂抗-HCV检测操作规程页码：共页第页CNCSM3SM11SM19SM27SM35SM43SM51SM59SM67SM75SM83DPCSM4SM12SM20SM28SM36SM44SM52SM60SM68SM76SM84EPCSM5SM13SM21SM29SM37SM45SM53SM61SM69SM77SM85FQCSM6SM14SM22SM30SM38SM46SM54SM62SM70SM78SM86GSM7SM15SM23SM31SM39SM47SM55SM63SM71SM79SM87HSM8SM16SM24SM32SM40SM48SM56SM64SM72SM80SM88123456789101112图1加样示意图NC-阴性对照PC-阳性对照QC-质控品SM-标本9.2.2以下步骤分为手工操作和FAME16\20后处理系统自动处理操作。9.2.2.1手工操作1）孵育：将加样混匀后的微孔板架放在37℃水浴箱湿方盘中孵育60分钟。水浴箱中的水应保持与微孔直接接触。2）洗板：将微孔板架从水浴箱中取出，放在汇松洗板机的载板架上，根据《汇松洗板机操作规程》选择编制好的洗板程序进行洗板，洗板时要对程序中的浸泡液量（500ul），浸泡时间30秒，洗板次数为5次进行确认。洗板结束后，将微孔板架放在干净纱布（或吸水纸）上将微孔中的水拍干。3）加酶结合物：将酶结合物轻轻混匀，按加样顺序在微板孔中加入酶结合物100ul。4）孵育：将加酶结合物后的微孔板架用配备的封口盖将所有微孔封盖，放在37℃水浴箱湿方盘中孵育30分钟，水浴箱中的水应保持与微孔直接接触。5）洗板：将微孔板架从水浴箱中取出，放在汇松洗板机的载板架上，根据《汇松洗板机操作规程》选择编制好的洗板程序进行洗板，洗板时要广安市中心血站文件编号：GAX/SOP-J-01操作规程版本/修订：2011/C/0标题：雅培试剂抗-HCV检测操作规程页码：共页第页对程序中的浸泡液量（500ul），浸泡时间30秒，洗板次数为5次进行确认。洗板结束后，将微孔板架放在干净纱布（或吸水纸）上将微孔中的水拍干。5）显色：在每个微孔中依次加入底物液100ul，放在37℃水浴箱中的干方盘中孵育30分钟。6）终止：将微孔板架从37℃水浴箱中取出，在每个微孔中加入终止液50ul，放在微量振荡器上混匀。加入终止液的顺序应与加入显色剂的顺序一致，加样时吸嘴不要接触微孔的底部和边缘。7）比色：根据说明书要求正确设置阴阳性对照孔位置及临界值计算公式，或直接调用酶标仪（手工操作）根据编制的程序用双波长读取各孔的OD值，打印原始报告。9.2.2.2FAME16\20后处理系统自动处理：将加好标本的微板放入FAME16\20后处理系统中，系统按照已编好的HBV-LZX程序检测,自动完成实验各步骤。微板放入系统操作执行《FAME16/20操作规程》或《全自动酶免分析系统实验操作规程》，检测完成后执行《AusLab操作规程》，对结果进行读取，打印原始报告。若因特殊情况造成FAME系统无法完成实验时，则首先确认实验运行情况是否正确以及进行到哪个步骤，并按本操作规程中9.2.2.1手工操作规程继续进行实验，并在相关过程记录中记录原因。10、初次检测结果判断10.1临界值计算：1、临界值（CUTOFF值）=阴性对照平均OD值（NC）+0.610.2结果判读规则：标本OD测定值cutoff*0.8值为抗-HCV无反应；标本OD测定值≥cutoff*0.8值为抗-HCV有反应性。广安市中心血站文件编号：GAX/SOP-J-01操作规程版本/修订：2011/C/0标题：雅培试剂抗-HCV检测操作规程页码：共页第页10.3结果准确性评估以上结果判断步骤完成后，仍需对结果的准确性进行评估确认，评估方法如下：确认微板的总体外观无花板，底部无水珠、污迹、孔内无弃物、无气泡、确认微板反应外观与判读的结果一致确认实验的对照品、质控品结果符合实验要求（见《室内质量控制程序》）。11、重验操作程序11.1重验标本的确定初次检测，标本测定值（OD）值≥cutoff*0.8值应进行重验，原始报告中记录为“可疑”11.2重验程序执行《初试反应性标本进一步检测程序》用原试剂对原血液标本和其对应的血辫标本进行双孔检测。11.3重验结果判断11.3.1临界值计算：见本规程10.1条款11.3.2单个重复检测血样结果判断规则：血样四孔中所有的OD测定值均cutoff*0.8值为抗-HCV无反应；其中任意一孔OD测定值≥cutoff*0.8值为抗-HCV有反应性。11.3.3酶标仪判读：见本规程10.3条款11.3.4结果准确性评估：见本规程10.4条款12、综合结果判断初次检测无反应性，抗-HCV检测结果判断为阴性。初次检测，重验皆有反应，抗-HCV检测结果判断为阳性。初次检测，重验结果不一致时，应查明原因，综合分析。一般以重复检测结果为判断依据。广安市中心血站文件编号：GAX/SOP-J-01操作规程版本/修订：2011/C/0标题：雅培试剂抗-HCV检测操作规程页码：共页第页13、质量控制13.1每板实验均使用0.5NCU/ml(或2NCU/ml)康彻思坦生物或卫生部临检中心的标准物质（质控血清）和试剂盒的阴性、阳性对照与标本一起进行实验，结果应符合说明书要求，即:阴性对照孔（NC）OD值≥0.25，应舍去；阴性对照平均（NC）OD值≤0.25；阳性对照平均（PC）OD值比阴性对照平均（NC）OD值大0.6。如果阴性对照和阳性对照的标准没有达到，应重新试验