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谷氨酸发酵机制第一节谷氨酸发酵机制1.谷氨酸的作用：谷氨酸(g1utamate，Glu，C5H9O4N)是中枢神经系统中一种最重要的兴奋性神经递质，主要分布于大脑皮质、海马、小脑和纹状体，在学习、记忆、神经元可塑性及大脑发育等方面均起重要作用。此外，谷氨酸对心肌能量代谢和心肌保护起着重要作用。一、谷氨酸生物合成途径生物体内合成谷氨酸的前体物质是a-酮戊二酸，是三羧酸循环(TCA循环)的中间产物，由糖质原料生物合成谷氨酸的途径包括糖酵解途径(EMP途径)、三羧酸循环、乙醛酸循环、CO2的固定反应(伍德一沃克曼反应)等。（一）、葡萄糖的糖酵解、三羧酸循环和乙醛酸循环1.糖酵解途径（EMP途径）将一分子葡萄糖分解成两分子丙酮酸,并且发生氧化(脱氢)和生成少量ATP。葡萄糖6-磷酸葡萄糖3-磷酸甘油醛丙酮酸6-磷酸葡萄糖酸5-磷酸核酮糖HMP途径EMP途径2.戊糖磷酸途径（HMP途径）可以生成酵解途径的中间产物6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛。肌肉中的葡萄糖代谢情况3.三羧酸循环（TCA循环）谷氨酸（胞内）转移到胞外草酰乙酸柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸α-酮戊二酸琥珀酸延胡索酸苹果酸丙酮酸乙酰CoA乙醛酸+CO2乙醛酸循环中的两个关键酶——异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶。异柠檬酸脱氢酶NH4α-酮戊二酸脱氢酶（二）谷氨酸合成的理想途径在发酵产酸期，EMP所占比例更大，约为74％。生物素充足菌EMP所占比例约为62％；（三）由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径3.在谷氨酸发酵的菌体生长期，由于三羧酸循环中的缺陷(丧失a-酮戊二酸脱氢酶氧化能力或氧化能力微弱)，谷氨酸产生菌采用乙醛酸循环途径进行代谢，提供四碳二羧酸及菌体合成所需的中间产物等。2.此代谢途径至少有16步酶促反应。1.谷氨酸生产菌株为缺陷型，生产过程分为菌体生长期和谷氨酸积累期。4.在菌体生长期之后，进入谷氨酸生成期，封闭乙醛酸循环，积累α-酮戊二酸，就能够大量生成、积累谷氨酸。因此在谷氨酸发酵中，菌体生长期的最适条件和谷氨酸生成积累期的最适条件是不一样的。5.由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径（1）在谷氨酸生成期，假如四碳二羧酸是100％通过C02固定反应供给，在生长期之后，理想的发酵按如下反应进行：1mol葡萄糖可以生成1mol的谷氨酸，谷氨酸对葡萄糖的质量理论转化率为：6.葡萄糖对谷氨酸的转化率（2）在谷氨酸生成期，若CO2固定反应完全不起作用，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的催化作用下，脱氢脱羧全部氧化成乙酰CoA，通过乙醛酸循环供给四碳二羧酸。反应如下：3C6H12O66丙酮酸6乙酰CoA乙醛酸循环：4乙酰CoA+4H2O2琥珀酸+4CoASH6乙酰CoA+2NH3+3O22谷氨酸+2CO2+6H2O3mol葡萄糖可以生成2mol的谷氨酸，谷氨酸对葡萄糖的质量理论转化率为：(3)实际转化率：处于二者之间，即54.4%～81.7%。CO2固定反应、乙醛酸循环的比率等对转化率影响较大。乙醛酸循环活性越高，谷氨酸越不易生成与积累。7.醋酸或正石蜡原料发酵谷氨酸的推测途径在醋酸发酵谷氨酸或石油发酵谷氨酸时，却只能经乙醛酸循环供给四碳二羧酸，四碳二羧酸经草酰乙酸又转化为柠檬酸。二、谷氨酸生物合成的代谢调节机制在工业上，通过对微生物代谢途径的控制来满足生产的需要，提高生产效益。所以，研究微生物代谢调节机制有极其重要的意义。合成代谢将分解代谢产生的能量和中间体合成氨基酸、核酸、蛋白质等物质。微生物的代谢分解代谢：合成代谢：从环境中摄取营养物质，把它们转化为自身物质，以此来提供能源和小分子中间体；1．糖代谢(EMP途径和HMP途径)的调节糖代谢可分为分解与合成两方面。糖分解代谢包括酵解与三羧酸循环；（提供能量）合成代谢包括糖的异生、糖原与结构多糖的合成等，中间代谢还有磷酸戊糖途径、糖醛酸途径等。（消耗能量）(1)能荷的调节腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷(腺苷三磷酸)，简称为ATP。其结构简式是：A—P～P～P，其相邻的两个磷酸基之间的化学键非常活跃，水解时可释放约30.54kJ/mol的能量，因此称为高能磷酸键。能荷调节是通过ATP、ADP和AMP分子对某些酶分子进行变构调节来实现的。Atkinson提出了能荷的概念。认为能荷是细胞中高能磷酸状态的一种数量上的衡量，能荷大小可以说明生物体中ATP—ADP—AMP系统的能量状态。能荷的大小决定于ATP和ADP的多少。能荷逐渐升高时，即细胞内的能量水平逐渐升高，这一过程中AMP、ADP转变成ATP。ATP的增加会抑制糖分解代谢，抑制如柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等酶的活性，并激活糖类合成的酶，加速糖原的合成。糖酵解主要受三个酶调节：磷酸果糖激酶、己糖激酶、丙酮酸激酶，其中磷酸果糖激酶是限速酶，己糖激酶控制酵解的入口，丙酮酸激酶控制出口；三羧酸循环的调控由三个酶调控，即柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和ā-酮戊二酸脱氢酶。两者都与能荷的控制调节相关。当生物体内生物合成或其它需能反应加强时，细胞内ATP分解生成ADP或AMP，ATP减少，能荷降低，就会激活某些催化糖类分解的酶(糖原磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等)或解除ATP对这些酶的抑制，并抑制合成糖原的酶(NN合成酶、果糖-1，6～二磷酸酯酶等)，从而加速酵解、TCA循环产生能量，通过氧化磷酸化作用生成ATP。(2)生物素对糖代谢速率的调节生物素对糖代谢的调节与能荷的调节是不同的，能荷是对糖代谢流的调节，而生物素能够促进糖的EMP、HMP途径、TCA循环。谷氨酸产生菌大多为生物素缺陷型。许多研究表明，生物素对从糖开始到丙酮酸为止的糖降解途径的比例并没有显著的影响，主要作用是对糖降解速率的调节。原因：碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢中的许多反应都需要生物素。生物素的主要功能是在脱羧-羧化反应和脱氨反应中起辅酶作用，并和碳水化合物与蛋白质的互变、碳水化合物以及蛋白质向脂肪的转化有关。在碳水化合物代谢中，生物素酶能催化脱羧和羧化反应。碳水化合物代谢中依赖生物素的特异反应有：丙酮酸转化生成草酰乙酸；苹果酸转化为丙酮酸；琥珀酸与丙酮酸的互变；草酰琥珀酸转化为α-酮戊二酸。2．三羧酸循环(TCA循环)的调节谷氨酸产生菌在代谢途径中，三羧酸循环的调节主要是通过5种酶的调节进行的。这五种酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶。谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力并阻遏柠檬酸合成酶的合成，使代谢转向天冬氨酸的合成。草酰乙酸+谷氨酸谷氨酸转氨酶天冬氨酸+α-酮戊二酸①磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。②柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和乌头酸的反馈抑制。反馈抑制：是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用。反馈抑制与反馈阻遏的区别在于：反馈阻遏是转录水平的调节，产生效应慢，反馈抑制是酶活性水平调节，产生效应快。此外，前者的作用往往会影响催化一系反应的多个酶，而后者往往只对是一系列反应中的第一个酶起作用。③异柠檬酸脱氢酶活力强，而异柠檬酸裂解酶活力不能太强，这就有利于谷氨酸前体物α-酮戊二酸的生成，满足合成谷氨酸的需要。异柠檬酸脱氢酶催化的异柠檬酸脱氢脱羧生成α–酮戊二酸的反应和谷氨酸脱氢酶催化的α-酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸的反应是一对氧化还原共轭反应，细胞内α–酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡，当α–酮戊二酸过量时，对异柠檬脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合成α–酮戊二酸。在谷氨酸的生物合成中，谷氨酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶在铵离子存在下，两者非常密切地偶联起来，形成强固的氧化还原共轭体系，不与NADPH2的末端氧化系相连接，使α–酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸。④沿着由柠檬酸至α–酮戊二酸的氧化途径，谷氨酸产生菌有两种NADP专性脱氢酶，即异柠檬酸脱氢酶和L-谷氨酸脱氢酶。由于谷氨酸产生菌的谷氨酸脱氢酶比其它微生物强大得多，所以由三羧酸循环所得的柠檬酸的氧化中间物就不再往下氧化，而以谷氨酸的形式积累起来。谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏。若铵离子进一步过剩供给时，发酵液偏酸性，pH在5.5～6.5，谷氨酸会进一步生成谷氨酰胺。⑤在谷氨酸产生菌中，α–酮戊二酸脱氢酶先天性缺失或微弱，对导向谷氨酸形成具有重要意义，这是谷氨酸产生菌糖代谢的一个重要特征。谷氨酸产生菌的α–酮戊二酸氧化力微弱，尤其在生物素缺乏的条件下，三羧酸循环到达α–酮戊二酸时即受到阻挡，这有利于α–酮戊二酸的积累，然后生成谷氨酸。3．乙醛酸循环(DCA循环)的调节乙醛酸循环中的关键酶是异柠檬酸裂解酶和苹果酸酶。通过乙醛酸循环异柠檬酸裂解酶的催化作用使琥珀酸、延胡索酸和苹果酸的量得到补足，其反应如下：葡萄糖和琥珀酸等对异柠檬酸裂解酶起着阻遏作用。在生物素亚适量条件下，琥珀酸氧化力降低，积累的琥珀酸会反馈抑制异柠檬酸裂解酶活性，并阻遏该酶的生成，DCA循环基本处于封闭状态，异柠檬酸高效率地转化为α–酮戊二酸，再生成谷氨酸。在生物素充足的条件下，异柠檬酸裂解酶活性增大，通过DCA循环提供能量，进行蛋白质的合成，不仅异柠檬酸转化生成谷氨酸的反应减弱使得谷氨酸减少，而且生成的谷氨酸在转氨酶的催化作用下又转成其它氨基酸，也不利于谷氨酸积累。(1)以糖质为原料的谷氨酸发酵中生物素对DCA循环的影响以醋酸为原料发酵谷氨酸时，醋酸浓度要低，高浓度的醋酸易被完全氧化。当菌体内的有机酸浓度低到一定程度，DCA循环启动，此时异柠檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸与细胞内的草酰乙酸共同抑制异柠檬酸脱氢酶，TCA循环转为DCA循环，不利于谷氨酸生成与积累；当DCA循环运转使得TCA循环包含的某些有机酸过剩时，异柠檬酸裂解酶被抑制，乙醛酸浓度下降，解除对异柠檬酸脱氢酶的抑制，TCA循环运转。(2)以醋酸为原料的谷氨酸发酵对DCA循环的影响4．CO2固定反应的调节CO2固定反应主要通过以下途径完成：C02的固定反应的作用：补充草酰乙酸；在谷氨酸合成过程中，糖的分解代谢途径与C02固定的适当比例是提高谷氨酸对糖收率的关键问题。5．NH4+的调节谷氨酸脱氢酶也能催化谷氨酸氧化脱氨反应，脱氨过程以NAD+作为辅酶，该酶催化的反应虽然偏向氨合成谷氨酸一边，但是脱氢过程产生的NADH被氧化成NAD+，同时产生的NH3很容易被除去。脱氨反应被NH4+和α–酮戊二酸所抑制，这对于谷氨酸的积累也起到了很好的作用。在谷氨酸发酵生产中，生物素缺陷型菌在NH4+存在时，葡萄糖消耗速率快而且谷氨酸收率高；NH4+不存在时，葡萄糖消耗速率很慢，生成物是α–酮戊二酸、丙酮酸等物质，不产生谷氨酸。四、细胞膜通透性的调节对谷氨酸发酵的重要性：当细胞膜转变为有利于谷氨酸向膜外渗透的方式，谷氨酸才能不断地排出细胞外，这样既有利于细胞内谷氨酸合成反应的优先性、连续性，也有利于谷氨酸在胞外的积累。细胞膜是在细胞壁与细胞质之间的一层柔软而富有弹性的半渗透性膜，磷脂双分子层为其基本结构，在双分子层中镶嵌蛋白质。一种是通过控制脂肪酸和甘油的合成，实现对磷脂合成的控制，使得细胞不能形成完整的细胞膜；一种是通过干扰细菌细胞壁的形成，使得细胞不能形成完整的细胞壁，丧失了对细胞膜的保护作用。在膜内外渗透压差等因素影响下，细胞膜物理性损伤，增大膜的通透性。根据细胞膜的结构特性，控制细胞膜通透性的方法主要有两种：1．控制细胞膜的形成①利用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时，限制发酵培养基中生物素的浓度。生物素参与了脂肪酸的生物合成，进而影响了磷脂的合成和细胞膜的形成。生物素是催化脂肪酸合成起始反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，对脂肪酸的形成起促进作用。选育生物素缺陷型菌株，阻断生物素合成，亚适量控制生物素添加，抑制不饱和脂肪酸的合成，使得细胞膜不完整，提高了细胞膜对谷氨酸的通透性。②利用生物素过量的糖蜜原料进行谷氨酸发酵时，添加表面活性剂或饱和脂肪酸。在生物素过量的条件下，添加表面活性剂或饱和脂肪酸