通往精准医学之路

通往精准医学之路国际著名的生物物理学家、哈佛大学化学与化学生物学系讲席教授、美国科学院院士、北京大学生物动态光学成像中心（BIOPIC）主任谢晓亮日前获得美国生物医学大奖——阿尔伯尼奖。颁奖前夕，谢晓亮教授应美国著名杂志《美国医学会杂志》（TheJournaloftheAmericanMedicalAssociation，JAMA）的邀请，发表了有关单分子技术与基因组学的评述，并对这两个领域与蓬勃兴起的精准医学的关系作了详细介绍。2014年，两个健康的试管婴儿来到人世，被视为“带动”单分子生物学技术的一大进步。因为他们的健康有赖于出生前一项单分子层面的检测技术，该技术让他们减少了携带父母体内的遗传病基因的可能。这对于防患遗传病和整个生物医学都意义重大。在单分子生物学研究领域作出这样的技术创新，并将其应用于试管婴儿遗传性疾病的预防，正是谢晓亮成为首个阿尔伯尼奖华人科学家得主的原因。不过，如此重要的单分子生物学还是一个年轻的学科。谢晓亮在最新发表于JAMA的文章中介绍，在过去20年里,单分子成像与操纵领域的进展迅速，孕育出一门基于观测单个分子理解生物过程的新学科——单分子生物学。在全世界许多实验室的推动下，这个崭新的领域改变了我们对于许多生物学问题的思考与理解，并产生出很多新知识。结缘单分子谢晓亮与单分子生物学缘起于上个世纪90年代初。谢晓亮带着在室温下单分子成像的想法进入美国西北太平洋国家实验室，成为该实验室第一位中国籍科学家。1998年，谢晓亮的研究组在《科学》上发表了对胆固醇氧化酶催化的研究（图1），这是一个单分子生物学的早期经典案例。胆固醇催化酶所含有的核黄素辅基在氧化态下是天然发光的荧光基团，而在还原态下则不发光，所以每一次荧光的“亮/灭”循环对应着一个酶分子催化状态的翻转。这一特点使得对单个酶分子反应的实时观测成为可能。“在单分子层面上，化学反应是随机发生的，即化学反应发生所需的等待时间是随机分布的，而不像在拥有大量分子系统中的反应那样有可被推测的结果。由于很多生物大分子，例如DNA，是以单分子或者少量几个分子的形式存在于细胞之中，故能对单分子化学反应进行实时观察就尤为重要。”谢晓亮在上述最新文章中表示。图1.单个胆固醇氧化酶分子E的荧光信号显示出酶反应发生时氧化态核黄素（FAD*，发荧光）和还原态核黄素（FADH2，不发光）状态之间的转换是随机的。对胆固醇氧化酶催化的研究成果奠定了单分子酶学领域发展的基础，谢晓亮也成为该领域的奠基人。谢晓亮在前述文章中指出，单分子酶学具有实际应用意义。例如，单分子测序仪可以监测单个DNA聚合酶分子将有荧光标记的核苷酸逐个合成到一个单链DNA模板上的过程，从而直接读取DNA分子的序列。尽管单分子测序仪目前在成本、准确性和通量方面尚不能与基于大量分子的DNA测序仪相竞争，但它具有一个独特的优势：能够对很长的DNA序列进行测序。“2007年以来基于大量分子（还不是单分子）的‘新一代’DNA测序仪的出现，已开启了激动人心的个体化医疗的新纪元。”谢晓亮说。开创新领域在基础研究领域，单分子生物学不仅在体外而且在活细胞内增进了人们对许多大分子系统工作机理的深入理解。继单分子酶学之后，谢晓亮又开创了活细胞中的单分子研究。谢晓亮解释说，一个基因在单个细胞中只有一个或者两个拷贝，基因表达的过程和单个酶分子反应一样，也是随机发生。因此，单分子生物学与单细胞生物学是密切相关的。近年来，谢晓亮的研究团队对单个活细胞中mRNA和蛋白质分子逐个产生的随机过程进行了详细的研究，从而使得分子生物学的“中心法则”在单分子层面上得到了定量的描述。2006年，其在《自然》和《科学》发表论文，首次介绍在活细胞中逐个观察基因表达的方法，该方法让科学家们能够以前所未有的方式在单分子层面上研究基因调控。DNA以单分子（单个染色体）的形式存在于每一个人体细胞中，所以基因组的变化也是随机发生的。相应地，人类生殖细胞分裂时发生的随机重组使得每一个细胞都不相同，比如癌细胞中剧烈的基因组变化也使得原发肿瘤中的细胞之间存在高度的异质性。在一个细胞中，最常见的基因组改变包括单核苷酸变异（SNV，一种单碱基对的点突变）和基因拷贝数变异（CNV）。谢晓亮在文中介绍，在人类整个基因组的六十亿个碱基对中，任何一个特定的SNV便可能导致遗传性疾病；CNV则通常发生在生殖细胞分裂时的染色体分离过程中以及肿瘤细胞内基因组的重排错误（包括插入、缺失、染色体倒位和易位）。“由于SNV和CNV在不同细胞中的发生是随机的、不同步的，因此每个细胞都拥有不同的基因组，这使得单细胞测序成为必需。而直到最近，由于单细胞基因组学的发展，这种必需才变得可行。”他说。专注精准医疗约7000种单基因遗传疾病会严重影响人类健康，并对病人家庭和社会医疗体系产生沉重负担。例如染色体异常，即染色体层面上的拷贝数变异，是流产及许多遗传性疾病如唐氏综合症的主要致因。如果能够提前发现这些不好的基因变化，那么将减少人们受到病痛的折磨的几率。这些让单细胞基因检测成为被需要的技术。给单个人类细胞做全基因组测序需要对其进行全基因组扩增（WGA）（图2）。谢晓亮研究组于2012年发表在《科学》的一篇文章，介绍了他们研发的一种新方法。这种方法被称为“多重退火循环扩增法”（下文简称MALBAC）。相比之前被广泛应用的MDA方法，MALBAC能够更准确地检测SNV和CNV，在人体细胞中数字化地计数一个基因的拷贝数,并且能够没有假阳性地检测单个SNV，虽然仍可能会有一定的假阴性。图2.单细胞的全基因组扩增（WGA）过程。谢晓亮在北京大学生物动态成像中心的团队与该中心的汤富酬团队、白凡团队、北医三院的乔杰团队以及北京肿瘤医院的王洁团队合作，成功地把MALBAC用于协助人工辅助生殖和癌症的研究。“把MALBAC用于协助人工辅助生殖和癌症的研究，两者皆对精准医学有着重要意义。”谢晓亮在上述文章中说。在人工辅助生殖领域，为了避免染色体异常和单基因疾病的遗传，MALBAC已经被应用于胚胎植入前基因组筛查(PGS)和胚胎植入前遗传学诊断(PGD)(图3)。谢晓亮介绍说，虽然PCR、荧光原位杂交（FISH）和DNA微阵列芯片等方法都已经被用于PGD和PGS，MALBAC能够提供更高的精确度，并可以同时避免染色体异常和危险点突变的发生。2014年，两个“MALBAC婴儿”的出生得到了大量的关注和报道，并在国际学术界引起反响。在这两个案例中，研究人员成功地利用了MALBAC来筛选健康胚胎，使婴儿基因组中避免带有父母中一方所携带的遗传疾病基因。MALBAC极低的假阳性和假阴性率完美地满足了两个婴儿的父母希望后代不再携带严重的杂合致病突变的要求。这为那些患有遗传性疾病或携带遗传疾病基因的夫妻带来了福音。图3.人工辅助生殖体外受精植入前基因筛检PGS示意图（只显示一对染色体）。来自父亲（绿色）和母亲（红色）的染色体DNA发生过同源重组。受精后，胚胎发育不需要的第一和第二极体（卵细胞上方的两个小圆球）可以通过一个微细移液管取出，利用MALBAC方法进行WGA。对这两个极体或胚胎囊胚期的少数细胞进行测序，染色体异常（最上面）可以被避免，同时还可以检查出带有疾病基因的点突变（中间），从而增加健康婴儿植入的成功率（下面）。“类似的方法可以减少某些疾病，如乳腺癌在下一代中的遗传风险。”谢晓亮在文章中指出，选择一个风险较低的等位基因，如特定的BRCA基因序列，在技术上目前是可行的，但在伦理层面上还需要进一步讨论。据了解，谢晓亮与其团队也正在努力尝试将MALBAC技术应用于癌症的诊断。众所周知，癌症是一种基因组疾病。循环肿瘤细胞(CTC)在进入人体外周血液循环后可能介导癌细胞的转移，并引发90%与癌症相关的死亡。而谢晓亮等人研究发现循环肿瘤细胞与原发肿瘤细胞有所不同。他们使用MALBAC分析肺癌患者的单个循环肿瘤细胞基因组，发现其循环肿瘤细胞的CNV模式在一个病人体内以及在患同一种癌症的不同病人中是相似的，但在不同的癌症类型中是截然不同的。此外，这些循环肿瘤细胞中重复出现的CNV模式与患者的转移灶肿瘤细胞CNV模式也是一致的。在上述文章中，谢晓亮指出，“显然,染色体特定区域拷贝数的增减模式被肿瘤转移所选择。循环肿瘤细胞的CNV模式与癌症类型有关这一发现为研究人员提供了基于CNV模式进行无创癌症诊断的可能。因此，单细胞全基因组扩增方法的进一步发展将有助于科学家能够更好地了解肿瘤异质性和癌症转移的机制，而且有望实现对癌症的精准化诊疗。”谢晓亮在文章的最后强调了自己的核心观点，DNA以单分子的形式存在于每个细胞中，因此基因表达和基因组的变化是随机发生的，这也使得在单细胞和单分子水平上的测量成为必需。“单细胞基因组学发端于单分子技术与基因组学的交汇之处。”展望未来，谢晓亮写道，“在单细胞中进行精确基因拷贝数的计数以及基因点突变的检测现在不仅已成为可能，而且正在成为日益重要的技术。这些手段使得科学家们能够在单个分子的层面上检测、理解并改善生命过程，也成为‘精准医学’的生动案例。”参考文献：[1]XieXS.SingleMoleculesMeetGenomics:PinpointingPrecisionMedicine.JAMAPublishedonlineMay14,2015.doi:10.1001/jama.2015.5533[2]LuHP,XunL,XieXS.Single-moleculeenzymaticdynamics.Science.1998;282(5395):1877-1882.[3]ZongC,LuS,ChapmanAR,XieXS.Genome-widedetectionofsingle-nucleotideandcopy-numbervariationsofasinglehumancell.Science.2012;338(6114):1622-1626.