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11超声对大鼠牙骨质修复过程中TGF-β1表达和OPG/RANKL表达比值的影响*李晓彦霍俊滨霍娜刘永召王晓玲徐娟目录超声对大鼠牙骨质修复过程中TGF-β1表达和OPG/RANKL表达比值的影响*.......................................................................11【摘要】目的：研究超声在大鼠牙骨质修复过程中对转化生长因子-β1(TGF-β1)表达和骨保护蛋白、核因子-KB受体活化因子配体(OPG/RANKL)表达比值的影响。方法：选择32只健康雄性Wistar大鼠建立正畸性牙根吸收动物模型，随机分为4组，每组8只，分别为空白对照组，单纯加力组，自然修复组，超声修复组，其中用频率1.5MHz，强度100MW/cm2的治疗超声对超声修复组的实验牙在2周的修复期进行每天15min治疗超声照射。2周治疗结束后，取上颌第一磨牙及其牙周组织，制作以上颌第一磨牙为中心的，近远中方向的组织切片，行TGF-β1，OPG，RANKL，免疫组化染色，光镜观察并作免疫组化光密度分析，对实验结果进行单因素方差分析。()∑()结果：超声修复组TGF-β1的光密度值(0.36228±0.02833)，明显高于自然修复组(0.24576±0.03183)，差异有统计学意义。超声修复组OPG/RANKL光密度值比值(1.1126±0.096)，也明显高于自然修复组(0.7835±0.067)差异有统计学意义。结论：超声通过上调TGF-β1表达，改变OPG/RANKL的比值，促进牙骨质的修复重建。关键词：超声；牙根吸收；牙骨质；TGF-β1；OPG/RANKL[中国图书分类号]R782.1[文献标识码]A[文章编号]1009-3761(2013)01-0011-05EffectsofultrasoundontheexpressionsofTGF-β1andOPG/RANKLratioduringcementumreconstructionpro－cessinrat口腔颌面修复学杂志2013年1月第14卷第1期CHINESEJOURNALOFPROSTHODONTICSJANUARY2013VOL.14NO.1·12·LIXiao-yan,HUOJun-bin,HUONa,LIUYong-zhao,WANGXiao-ling,XUJuan.(DepartmentofOrthodontics,GeneralHospitalofChinesePLA,Beijing100853,China)【Abstract】Objective:TostudytheeffectofultrasoundontheexpressionsofTGF-β1andOPG/RANKLintheratce-mentumreconstructionprocess.Methods:32healthymaleWistarratswereestablishedasanimalmodelsoforthodonticrootresorption,andrandomlydividedintofourgroups(thecontrolgroup,experimentalgroup,naturalrecoverygroup,ultra-soundrepairgroup)with8ineachgroup.Theultrasoundrepairgroupweregiven1.5MHz100MW/cm2ultrasoundirradia-tionfor15minperdayinthetwoweeksofrepairperiod.Upperfirstmolar-centeredmesial-distaltissueslicesweregenerat-edfromtheupperfirstmolarsandperidentiumoftheratsfromeachgroup.Specimensliceswereanalyzedwithhema-toxylin-eosinstaining,OPG,RANKL,TGF-β1immunohistochemistry,andopticalmicroscopy.Analysesofdensitometry,andone-wayanalysisofvariancewereperformed.Results:expressionsofTGF-β1densitometryofultrasoundrepairgroup(0.36228±0.02833)weresignificantlyhigherthannaturalrepairgroup(0.24576±0.03183).expressionsofOPG/RANKLdensitometryratiosofultrasoundrepairgroup(1.1126±0.096)weresignificantlyhigherthannaturalrepairgroup(0.7835±0.067).Conclusion:ultrasoundpromotedtherepairandthereconstructionofthecementumbyincreasingtheexpressionsofTGF-β1andOPG/RANKLratios.Keywords:ultrasound;rootresorption;cementum;TGF-β1;OPG/RANKL*基金项目：全军医学科技“十二五”科研项目(项目编号：CWS11J117)13牙根吸收是正畸治疗的常见并发症，发生率在3%-100%[1]。牙根吸收的机理与骨吸收基本类似，由与破骨细胞形态和生物学功能相似的破牙骨质细胞承担主要破牙骨质功能。与牙根吸收的这一破坏性过程相伴随的是牙周膜组织的修复活动，当牙根吸收的进程停止，破牙骨质细胞失去活性并从牙根表面分离出去，成牙骨质细胞开始进行修复活动，类牙骨质修复基质沉积，钙化，新生牙骨质形成[2]，新生牙骨质在吸收陷窝中沉积，牙周膜重建，修复吸收所造成的缺损[3]。在这种吸收-修复转换的过程中，多种调控因子共同参与成牙骨质细胞祖细胞的募集，表达，分化，和牙骨质的修复。其中，骨保护蛋白(os-teoprotegerinOPG)、核因子-KB受体活化因子配体(receptoractivatornuclearfactorkappaBligandRANKL).转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-βTGF-β)均参与这一过程并发挥其作用[4]。超声是一种辐射频率高于人类听觉范围的声波辐射，以高频声学压缩波传导至人体组织，能在生理和生物化学方面对细胞产生较大影响，并能作为一种生物活性治疗工具[5]。在体外细胞实验中，超声可影响多种细胞因子的表达；在骨科和齿科领域，超声已被报道用于骨不连的位置增强骨形成[6]。很多研究也显示超声能够抑制牙根吸收，并促进牙骨质的修复，本研究对其机制进行深一步探讨。1.材料和方法1.1实验动物及分组选择8周龄的健康雄性Wistar大鼠32只(解放军总医院实验动物中心提供)，将其按体重编号，并随机分为4组，每组8只，分别为空白对照组，单纯加力组，自然修复组，超声修复组。1.2动物模型的建立在健康雄性wistar大鼠口内置入加力装置，在切牙与第一磨牙间置入镍钛拉簧，施以100g力(1g=9.8×10-3N)，加力2周，为牙齿加力期，建立正畸性牙根吸收模型；后去除加力装置，观察2周，为牙根修复期，用以观察牙根吸收陷窝的修复情况。动物模型建模标准参照参考文献[7]。实验以大鼠右侧上颌第一磨牙为实验牙，0.7ml/kg速眠新注射液(军事医学科学院军事兽医研究所)腹腔注射麻醉后仰卧固定，左右中切牙远中轴角龈缘磨沟，由0.012英寸(1英寸=2.54mm)镍钛拉簧(圣玛特公司)加载于两颗中切牙与第一磨牙之间，同一实验者用测力计(长沙天天齿科有限公司)测力两次，确保初始力值100g，0.20mm结扎丝结扎，同时牙釉质粘结树脂增强固位。每天检查弹簧，以防脱落。空白对照组不接受任何处理，其余三组的大鼠均在口内置入加力装置，加力两周后，单纯加力组的大鼠断颈处死，取组织标本备用；自然修复组和超声修复组的大鼠在加力两周后去除加力装置，在加力侧第一和第二磨牙之间填充自凝树脂材料，以保持第一磨牙不再发生移动；超声修复组大鼠剃去实验侧面颊部毛发，在2周的修复期每天用频率1.5MHz,强度100MW/cm2的低频超声治疗仪(Smith&NephewMedicalInc型号EXOGEN2000+)紧贴实验侧皮肤(有效作用面积4cm2)，照射15min。1.3组织标本制备加力2周后将动物断颈处死取材，进行组织学分析。将标本固定于10％中性缓冲甲醛溶液中48h，经15%EDTA(乙二胺四乙酸)溶液脱钙45d，75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、99.9%乙醇逐级脱水，二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，制作以上颌第一磨牙为中心的近远中方向的4μm厚的组织切片。1.4HE染色，TGF-β1，OPG，RANKL免疫组化染色本实验采用TGF-β1，OPG，RANKL多克隆抗体(SantaCruz，美国)，SP免疫组化试剂盒和DAB显色盒(北京中山生物公司)，按说明书步骤进行免疫组化染色，以PBS(pH7.4的磷酸盐缓冲液)代替一抗做阴性对照，选取大鼠远中第三牙根根尖近中区，运用Imagepro-Plus6.0软件测量各组单个光镜视野(×400)下阳性产物的平均光密度值。1.5统计学分析运用SPSS13.0统计软件对数据行单因素方差分析，采用组间多重比较SNK-q检验法。2.结果组织学染色结果显示：牙根吸收主要发生在牙根的受力侧。与自然修复组相比，超声修复组可见增厚的修复性牙骨质(见图1)。口腔颌面修复学杂志2013年1月第14卷第1期CHINESEJOURNALOFPROSTHODONTICSJANUARY2013VOL.14NO.1·14·空白对照组和自然修复组OPG表达为弱阳性，单纯加力组和超声修复组OPG表达阳性(见图3)。空白对照组和自然修复组RANKL表达阳性，单纯加力组RANKL表达强阳性,超声修复组RAN-KL表达弱阳性(见图4)。A空白对照组:牙骨质完整连续，无吸收陷窝B单纯加力组：部分牙骨质丧失，可见大量深而不规则的吸收陷窝A空白对照组：OPG表达弱阳性B单纯加力组：BOPG表达阳性C自然修复组:牙骨质不连续，局部可见少量新生牙骨质形成D超声修复组：可见吸收陷窝中大量形成新生牙骨质，如箭头所示图1各组大鼠根尖近中区HE染色(×100)免疫组织化学染色结果显示：TGF-β1，OPG，RANKL阳性表达定位于细胞质，呈现棕黄色；牙周膜，牙骨质以及骨吸收陷窝内的破骨细胞均为阳性表达部位。PBS代替一抗做阴性对照，未见阳C自然修复组：OPG表达弱阳性D超声修复组：OPG表达阳性性表达，空白对照组和单纯加力组TGF-β1表达阳性，自然修复组TGF-β1表达弱阳性，超声修复组TGF-β1表达强阳性(见图2)。图3各组大鼠根尖近中区OPG免疫组化染色(×400)A空白对照组：RANKL表达阳性B单纯加力组：RANKL表达强阳性A空白对照组：TGF-β1表达阳性B单纯加力组：C自然修复组：TGF-β1表达弱阳性151四组大鼠根尖近中区TGF-β1平均光密度值比较分组TGF-β1平均光密度值性破骨细胞数目增加[10]。转化生长因子-β1(TGF-β1)能够调节多种细胞空白对照组单纯加力组自然修复组0.28053±0.026150.28141±0.021840.24576±0.03183ab的生物学功能，不仅能够刺激成骨母细胞的增殖和活化，促进成骨形成，还可调节破骨细胞形成。在超声修复组0.36228±0.02833abc注：a：与空白对照组相比P0.01；b：与单纯加力组相比P0.01；c：与自然修复组相比P0.01。表2四组大鼠第三牙根尖近中区OPG/RANKL