超氧化物歧化酶的研究

超氧化物歧化酶的研究班级：生物班姓名：胡金金学号：11摘要:超氧化物歧化酶是生物体内清除超氧阴离子自由基的一种重要酶,具有重要的生理功能,在医药、食品、化妆品中有广泛的应用前景。现从分类、分布、结构、理化性质、催化机理、分离提取工艺、应用前景等方面探讨了超氧化物歧化酶的基础研究进展。关键词：超氧化物歧化酶、理化性质、生物学功能、提取工艺、应用前景到现在为止,人们已从细菌、原生动物、藻类、霉菌、植物、昆虫、鸟、鱼类和哺乳动物等生物体内分离得到SOD。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,简称SOD),是一类广泛存在于生物体内的金属酶,能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应,平衡机体内的氧自由基,己成为化学及生物化学热门的研究课题。作为生物体内超氧阴离子自由基的清洁剂,SOD在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能,在医学、食品、化妆品等领域得到越来越多的应用。目前,世界各地学者对SOD的研究方兴未艾,深入研究SOD不仅有着大的理论意义,也有着重大的实际应用价值。1超氧化物歧化酶的结构和理化性质1.1超氧化物歧化酶的结构超氧化物歧化酶(SOD)从结构上可分为两族:CuZn-SOD为第一族,Mn-SOD和Fe-SOD为第二族。天然存在的SOD,虽然活性中心离子不同,但催化活性部位却具有高度的结构同一性和进化的保守性,即活性中心金属离子都是与3或4个组氨酸(His)、咪唑基(Mn-SOD含1个天门冬氨酸羧基配位)和1个H2O分子呈畸变的四方锥或扭曲的四面体配位。CuZn-SOD作为SOD结构上的第一族,是人们对于SOD结构研究的突破口,也是人们了解最多的一种SOD。比较不同来源的CuZn-SOD的氨基酸序列可以发现,它们的同源性都很高。有些氨基酸还很保守,在所有序列中都不变,这暗示着这些氨基酸与活性中心有关。如图1牛红细胞CuZn-SOD的结构所示:每个铜原子除分别与4个组氨基酸残基(His441461611118)的咪唑氮配位外,还与一轴向水分子形成远距离的第五配位,Zn则与3个组氨酸残基(His61169178)和1个天冬氨酸(D81)配位。Cu、Zn共同连接组氨酸61组成/咪唑桥0结构。图1牛红细胞CuZn-SOD的结构示意图图1牛红细胞CuZn-SOD的结构示意图[1]]Mn-SOD和Fe-SOD同属于SOD结构上的第二族,Mn-SOD是由203个氨基酸残基构成的四聚体,Mn(Ó)是处于三角双锥配位环境中,其中一轴向配位为水分子,另一轴向被蛋白质辅基的配位His-28占据,另3个配基His-83、His-170和Asp-166位于赤道平面。Fe-SOD的活性中心是由3个His,1个Asp和1个H2O扭曲四面体配位而成。1.2超氧化物歧化酶的理化性质SOD的等电点偏酸性,为酸性蛋白SOD对热、pH值和蛋白水解酶的稳定性比一般酶要高。三种SOD的主要理化性质见下表[2]。2超氧化物歧化酶生物学功能2.1超氧化物歧化酶与胁迫生存环境的变化是不可避免的,任何生物必须去适应各种变化.以植物为例,经研究发现,不同条件、不同物种、不同的发育时期及不同器官发生胁迫后,SOD活性表现有升有降。然而SOD活性不论是升高还是降低,都表现出抗性强的品种比抗性弱的品种活性高.即当SOD活性降低时,抗性强的品种下降幅度小;而当SOD活性升高时,抗性强的品种升高幅度大;或者抗逆性强的品种活性升高而抗逆性弱的品种降低。这说明在逆境条件下植物的抗性强弱与植物体内能否维持较高的SOD活性水平有关。SOD的作用底物是生物体内产生的超氧阴离子自由基O厂,作用机理是:之后H2O2:被抗坏血酸和过氧化氮酶(前者是主要的)分解为H2O和O2,从而解除O2-所造成的氧化胁迫[3]。2.2.1超氧化物歧化酶的活性测定SOD的活性测定方法一般分直接测定法和间接测定法。直接测定法的原理是直接测定SOD催化反应的底物反应速度或产物生成速度。常见的直接测定方法有EPR法、脉冲辐解法、超氧化钾法等。直接法需专用的仪器,故此类方法一般实验室较难应用。间接测定法是通过某种能产生O-2的系统,使O-2进行另一个便于检测的反应,测定特征波长下的光吸收变化速率,计算SOD对这个反应的抑制程度从而间接定量SOD活性。常见的间接测定方法有黄嘌呤氧化酶-细胞色素C法、邻苯三酚自氧化法、微量邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶-NBT法、NBT光还原法等。2.2.2超氧化物歧化酶活性的影响SOD的催化活性主要与SOD活性中心的氨基酸残基、金属离子及其配位环境、/咪唑桥0的变化有关。SOD活性中心的精氨酸和组氨酸对SOD的催化活性具有极其重要的意义。这两个氨基酸离中心金属离子非常近,而且均带有正电荷,能诱导底物O-2,进入活性中心,并可在催化过程中提供H+以加快歧化反应速度。如这两个氨基酸残基被破坏或修饰,SOD将会失活。SOD中心金属离子的作用也不相同。对于CuPZn-SOD,Zn(Ò)的作用一是调节咪唑基与Cu的相互作用,二是稳定活性中心的结构。若除去酶分子中Zn(Ò)而保留原有环境中时Cu(Ò),SOD仍有相当高的活性。Cu(Ò)与酶催化作用有关,起着传递电子的作用。若除去Cu(Ò),则SOD将会失活,重新加入Cu(Ò)后SOD的酶活性恢复。另一方面,Cu(Ò)所处的环境对活性有重要影响。若以其它金属离子代替Cu(Ò),同时用Cu(Ò)代替Zn(Ò),则酶失去全部活性。另外,只有结合态的Cu(Ò)才直接与活性有关,但在一定浓度范围内,增加游离的Cu(Ò)的浓度可显著提高SOD活性[4]。对/咪唑桥0配合物进行催化的研究表明,在催化过程中,/咪唑桥0在与铜相连的一侧的N原子迅速地发生了质子化和去质子化的变化[5],对酶的催化活性有重要影响。3超氧化物歧化酶的提取3.1超声波超氧化物歧化酶提取流程取新鲜蒜瓣，去皮洗净，用匀浆机匀浆1.5min，分别分成6组、8组，每组30g，取6组分别用200～450W功率超声波破碎4min，另取8组按上述确定的功率破碎0～7.0min，在每组蒜汁中加入1.5倍体积0.05MpH7.8的磷酸缓冲液，浸提8h（4℃），离心得浸提液，测定浸提液中的总蛋白含量及总酶活性，取三次的平均值。超声波提取超氧化物歧化酶是目前最常用效率高的提取方法[6]。3.2纯化工艺方法[7]3.2.1热变性法热变性法是提取工艺中一种较为廉价的方法,可以降低生产成本,并且简单易行。热变性法不引入其他杂质,对提取工艺非常有利。SOD是一种热稳定性较好的酶,并且大部分杂蛋白在55℃时就可变性,因此可以利用SOD和杂蛋白变性温度的差异来实现初步分离。3.2.2丙酮分级沉淀法向蛋白质溶液中加入有机溶剂丙酮,水的活度降低。随着有机溶剂浓度的增大,水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低,溶液的介电常数下降,蛋白质分子间的静电引力增大,发生沉淀。有机溶剂密度较低,易于沉淀分离;与盐析法相比,沉淀产品不需脱盐处理。但该法容易引起蛋白质变性,必须低温下进行。3.2.3硫酸铵盐析法硫酸铵是常用的盐析盐。因为其价格便宜,操作简单,安全(溶解度大且受温度影响小,具有稳定蛋白质的作用),且可较好的保持SOD的活性,它常被用在蛋白质初级纯化和浓缩。3.2.4层析法层析是获得SOD精品的重要一步,对SOD比活力有很大提高,在经过沉淀分级后常采用层析方法纯化SOD提取液,目前国内外对层析的多步组合纯化研究较活跃。4超氧化物歧化酶的模拟研究与天然SOD相比,SOD的模拟物有着更显著的优点。首先是获取和制备比天然SOD要简单得多。天然SOD要从人或其它生物中提取,这就决定了天然SOD的提取必然困难重重,而且产量不高。而模拟SOD可以用化学方法来人工合成,其物质和能量消耗低,且产量不会受到限制。其次,天然SOD作为一种生物大分子,在进入体内时存在着诸如进入细胞能力弱、细胞渗透性差、在血中半衰期短(在人体中SOD只是在很短时间内稳定,其半衰期为分钟级)、不能口服、价格昂贵等缺点。另外,对于非人体SOD还存在着造成免疫损伤的可能。所以人们把目光投向了SOD模拟物,尤其是低分子量模拟物上。目前,生物无机化学家们合成和表征了一系列含铜、锰、铁等金属离子的小分子配合物来模拟SOD,期待将来能用小分子模拟化合物代替SOD应用于临床。其中研究最多的含铜络合物是3,5-二异丙基水杨酸铜[Cu(3,5-DIPS),这是一种低分子量的亲脂性络合物,具有天然CuZn-SOD样活性,可以起到抗炎及减轻由链脲菌素诱导产生的糖尿病。合成的铁(Ò)-酪氨酸模拟SOD金属酶,分子量比天然酶小得多,与天然SOD活性差距较小,且毒性小,从而大大推进了人工合成具有分子质量较小、稳定性高、毒性较底、活性较高等优点的SOD模拟物的研究工作。但是由于超氧化物歧化酶的模拟属于新型交叉学科,需要化学和生物学知识乃至技术的高度结合,目前的模拟还没有走向成熟,相信随着21世纪化学生物学的崛起,这一新兴交叉学科将会对化学、生物学及医学产生深远的影响[1]。5超氧化物歧化酶的应用5.1SOD在医药上的应用[8]SOD的药用研究,国内外主要用于治疗因超氧阴离子伤害引起的疾病如心肌缺血与缺血再灌注综合症、类风湿关节炎、红斑狼疮等。5.1.1治疗心肌缺血与缺血再灌注综合症心肌缺血与缺血再灌注损伤是当今十分活跃的研究领域,它揭示了过去某些临床难以解释的疾病矛盾,例如在冠状动脉的搭桥手术、溶栓术、变异型心绞痛及冠状动脉痉挛缓解再时导致的病情恶化等均与O2-存在密切相关。实验证明,心肌缺血再灌注损伤过程O2-产生增加[9],O2-通过膜的脂质氧化损伤心肌细胞内线粒体膜、内质网膜和溶酶体膜,从而破坏了机体的正常代谢。如果在这个时候注射适量的SOD便可有效防治/综合症0出现。SOD除应用于心脏和小肠动脉缺血再灌注外,也可应用于肝、肾、心脏等器官的保存和移植,断肢再植,整形美容等手术过程。5.1.2治疗炎症炎症是机体受到外界微生物入侵后的一种保护性反应。吞噬细胞在炎症反应中起着重要作用,它们在吞噬过程或受剌激产生呼吸爆发,消耗氧气,释放大量活性氧自由基,如O2-和羟基自由基(#OH),从而直接毒害真核细胞,损伤内皮细胞,红细胞,成纤维细胞,血小板和精子,白细胞本身也能被它自己产生的氧自由基损伤。用SOD治疗角叉菜胶诱导的胸膜炎,可减少胸腔积液和白细胞的积累。SOD还可以抑制关节炎,干扰白细胞在肾小球炎症部位的积累。SOD可以抑制黄嘌呤氧化酶引起的急性气管炎导致的器官通透性的改变,减少多形核白细胞在肺部的积累。由此可见,SOD用于治疗炎症具有很好的应用前景。5.1.3治疗自身免疫性疾病动物实验已证实SOD和其它氧自由基的清除剂能抑制自身免疫性疾病的慢性发病过程。研究表明:人类红斑性狼疮患者血清中有一种能使染色体破坏的介裂因子,这种因子的存在与O2-出现息息相关,类风湿关节炎病人血液中SOD活性比正常人低得多,故上述两种病人均可用SOD治疗。5.2SOD在食品工业中的应用在新鲜和加工的食品中,往往存在有超氧自由基(O2-)。这些超氧自由基能迅速氧化诸如抗坏血酸、A-生育酚之类的重要营养组分。对哺乳动物源中SOD的研究表明,SOD对乳本身起到抗氧化的作用,现已发现在牛乳中SOD在71.7e下经15s后,仍对巴氏消毒作用有抵抗作用,SOD能除去诱发脂类过氧化作用的超氧自由基,从而达到防止牛乳败坏的目的。实验表明,超氧自由基可能是引起异味和变色化合物的潜在的前体,这些化合物在某些条件下经过氧化酶的氧化作用而形成。过氧化酶活性通常被人们认为对植物性食物的品质有害,SOD对防止由于过氧化酶活性而引起质量降低有一定的作用。脂肪过氧化反应可以通过黄嘌呤氧化酶体系产生O2-或通过脂氧化酶来诱发,但存在SOD时则被抑制,已发现鲚油自动氧化作用由于SOD的存在而延缓。由上述可以看出,超氧物歧化酶是一种可能作为食品天然抗氧化剂的酶。目前超氧物歧化酶已被申请专利作为食品中抗氧化剂。国外把SOD作为食品添加剂的例子是加在口香糖和饮料中。5.3在化妆品中的应用据悉,国