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遗传标记STR基因座的高分辨电泳分型摘要：STR（ShortTandemRepeat，短片段重复序列）广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，具有高度多态性，一般由2～6个碱基构成一个核心序列，核心序列串联重复排列，由核心序列重复数目的变化产生长度多态性。本实验用磁珠法提取人类基因组DNA后，用三对引物（D1S1677、D4S2364和D10S1248）分别对一号染色体、四号染色体和十号染色体的STR序列进行PCR扩增，通过聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE）对PCR产物进行分离，最后用EB染色凝胶后在紫外灯下观察实验结果并进行分析。通过此次实验，我们了解了STR序列的特征和相关应用，掌握了磁珠法提取人类基因组DNA技术、PCR技术，以及聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE）。关键词：STR磁珠法PCR扩增聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE）1．引言DNA指纹技术是一项具有广泛应用价值的技术。它在人类医学中被用于个体鉴别、确定亲缘关系、医学诊断及寻找与疾病连锁的遗传标记；在动物进化学中可用于探明动物种群的起源及进化过程；在物种分类中，可用于区分不同物种，也有区分同一物种不同品系的潜力。在作物的基因定位及育种上也有非常广泛的应用。DNA指纹技术的发展经历了三代。第一代DNA指纹技术利用了DNA指纹图谱。1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为“DNA指纹”，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。众多“DNA指纹”组成“DNA指纹图谱”。第二代DNA指纹技术用PCR的方法对STR位点进行PCR扩增可得到不同长度DNA片段，用银染或荧光的方法对扩增后的DNA片段检测得到DNA指纹。第三代DNA指纹技术是用PCR的方法对SNP位点进行PCR扩增。STR（ShortTandemRepeat，短片段重复序列）广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，具有高度多态性。它们一般由2～6个碱基构成一个核心序列，核心序列串联重复排列，由核心序列重复数目的变化产生长度多态性。对于一个特定的个体，染色体上某个特定位置的重复序列的重复次数是固定的，而对于不同的个体在同一位置处的重复次数可能不同，这就构成了人群中这些重复序列的多态性。由于人类基因组中这种重复序列非常多，通过对这种多态性的检测，就可以明确区分个体与个体的不同，确定父母子的亲缘关系，这就是STR分型。联合应用16个STR位点的特异性，其个体识别率可达0.999999999998，其父权排除率可达0.99998。本次实验中人类基因组DNA的提取使用的是磁珠法核酸纯化技术。它采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。该方法快速简捷，一般可在36分钟内完成。不用多次漂洗磁珠也可确保基因组DNA的高纯度，提取出的基因组DNAOD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达20kb～50kb，可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是体外核酸扩增技术，由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。本实验以人类基因组DNA为模板，以dNTP为原料，以含有Mg2+的buffer为缓冲液，在Taq酶催化下，用特定引物（D1S1677、D4S2364和D10S1248）为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，获得不同基因座的STR扩增片段。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。总之，PCR是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。聚丙烯酰胺凝胶电泳（英语：polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE），可以用于分离蛋白质和寡核苷酸。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺（简称TEMED）和催化剂过硫酸铵（简称AP）或核黄素（C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，具有分子筛效应，因此，可以分离大小不同的STR扩增片段。核酸经过染色才能显示带型，最常用的是溴化乙锭染色法。EB（溴化乙锭）是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现凝胶中的核酸分子。在适当的染色条件下，荧光的强度是同DNA片段的大小（或数量）成正比。溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，与核酸形成络合物，在紫外线激发下，发出红色荧光。因此，可以在紫外灯下观察电泳结果。本实验用磁珠法提取人类基因组DNA后，用三对引物（D1S1677、D4S2364和D10S1248）分别对一号染色体、四号染色体和十号染色体的STR序列进行PCR扩增，通过聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE）对PCR产物进行分离，最后用EB染色凝胶后在紫外灯下观察实验结果并进行分析。2．材料和方法2.1材料、试剂和器材实验材料：人类口腔上皮细胞实验试剂：饮用水、BufferMACL、BufferMCL、ProteinaseK、BufferMA、MagicMagBeads、70%乙醇、TE(pH8.0)、碎冰、ddH2O、10×buffer（含Mg2+）、2.5mmol/LdNTP、10μmol/L引物（D1S1677-F、D1S1677-R、D4S2364-F、D4S2364-R、D10S1248-F、D10S1248-R）、1U/μlTaq酶溶液、琼脂糖、10×TBE、30%聚丙烯、APS、TEMED、电极缓冲液、6×loadingbuffer、20bpDNALadder、溴化乙锭（EB）实验仪器：10mL离心管、1.5mL离心管、台式高速离心机、微量移液器、蓝枪头、黄枪头、白枪头、恒温水浴锅、磁力架、PCR管、PCR仪、marker笔、贮槽、螺丝销钉、长玻璃板、短玻璃板、“凵”形硅橡胶框、细长头的滴管、电泳仪、紫外灯凝胶成像仪2.2方法2.2.1磁珠法提取人类基因组DNA（1）漱口：用10mL饮用水或自来水持续用力漱口，之后将其收集于10mL离心管中，2000rpm离心5min，将上清液小心用微量移液器吸除，沉淀为收集得到的口腔脱落细胞。（2）裂解：向细胞沉淀中加入400μLBufferMACL，200μLBufferMCL和20μLProteinaseK，用微量移液器反复吸打，均匀悬浮起细胞沉淀。然后将其转移至1.5mL离心管中。65℃水浴20～30min。12000rpm离心5～10min，小心取出500μL上清至新的离心管中。（3）结合：向样品中加入400μLBufferMA和10μLMagicMagBeads。剧烈颠倒震荡混匀10s。在加入MagicMagBeads之前，要将MagicMagBeads充分颠倒混匀。务必将MagicMagBeads加至液面以下，并尽量将枪头上残留的MagicMagBeads吸打干净。震荡后如管口沾有少量beads，用微量移液器吸取上清液并将其冲洗至离心管内。（4）磁吸附：将离心管至于磁力架上2min，待MagicMagBeads全部吸至离心管壁上，用微量移液器吸弃上清，然后从磁力架上取出离心管。吸弃上清时尽量吸净，但要避免吸入Beads。（5）洗涤：加入700μL70%乙醇，颠倒震荡混匀10s。震荡后如管口沾有少量beads，用微量移液器吸取上清液并将其冲洗至离心管内。将离心管置于磁力架上1min，待MagicMagBeads全部吸至离心管壁上后，用微量移液器吸弃上清，然后从磁力架上取出离心管。吸弃上清时尽量吸净，但要避免吸入Beads。（6）重复步骤（5）一次。（7）干燥：干燥前应尽量吸净上清，若出现液体挂壁现象，可将离心管短暂离心后，再次将其至于磁力架上1min，待MagicMagBeads全部吸至离心管壁上，用微量移液器吸净上清，然后从磁力架上取出离心管。室温开盖干燥15min（或者放入37℃的温箱中，放入时间不得超过5min）。（8）洗脱：加入20μLTE(pH8.0)，用枪头吸打混匀，将管壁上所有Beads都悬浮于TE溶液中。65℃水浴10min，间或摇匀，使DNA充分洗脱。（9）取出离心管，短暂离心，置于磁力架上1min，用微量移液器小心吸取上清至新的离心管，即获得基因组DNA。2.2.2PCR扩增人类的STR基因（1）取3个PCR管，做好标注后至于冰上，按照表1的PCR反应体系加样。表1PCR反应体系的构建成分体积（μL）ddH2O1610×PCR缓冲液（含MgCl2）2.52.5mmol/LdNTP110μmol/L引物1110μmol/L引物211U/μlTaq酶溶液0.5DNA样品325（2）将样品管稍稍离心集液于管底，按照表2设置PCR反应条件。表2PCR反应条件项目温度时间预变性94℃11min变性94℃1min复性59.4℃1min延伸72℃2min终延伸60℃30min保存10℃∞2.2.38%的聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE）（1）安装夹心式垂直板电泳槽。①装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。②将长、短玻璃板分别插到“凵”形硅橡胶框的凹形槽中，勿用手接触灌胶面的玻璃。③将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。④将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。⑤竖直电泳槽。在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂（糖）。凝固后的琼脂（糖）中应避免有气泡。（2）制胶与制备凝胶板。①配制36mL8%的PAGE凝胶两块，按照表3配置36mL的PAGE凝胶。35个循环表38%的PAGE凝胶标准配方成分体积ddH2O22.8mL10×TBE3.6mL30%聚丙烯9.6mLAPS200µLTEMED40µL②将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，距短玻璃上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。约30～60min凝胶完全聚合。加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。（3）加样与聚丙烯酰氨凝胶电泳①向20mLPCR样品中加入5µL6×loadingbuffer，混匀后取7µL加入到点样孔中。另外还要向点样孔中加入7µLDNAmarker。②开启电泳仪电源，选择合适的电压（180V）和时间（90min）。③将电泳槽电极与电泳仪连接。电泳槽红色电极为正极，与电泳仪正极相连。电泳槽黑色电极为负极，与电泳仪负极相连。④启动电泳，待观察到负极有气泡升起方可离开。⑤电泳结束，关闭电源，取出凝胶。⑥EB染色10min。⑦在紫外灯下观察凝胶图像。3．结果聚丙烯酰氨凝胶电泳实验结果如图1所示。12345678910111213141516171819202122图1聚丙烯酰氨凝胶电泳结果泳道1、8、15所上的样是20bpDNALadder，作用是指示所扩增STR片段的条带大致大小，该制品是由20bp至200bp间隔为20bp的10条片段和300bp、400bp、500bp共13条双链DNA片段组成。其中100bp、200bp、500bp是指示带，显示亮带，其它片段亮度相同。泳道1中的20bpDNALadder条带不明显，原因可能是加样量较少或者点样时间较长导致20bpDNALadder弥散。泳道2和泳道6中的20bpDNALadder均可看见13条带，由上至下条带大小分别为500bp、400bp、300bp、200bp、180bp、160bp、140bp、120bp、100bp、80bp、60bp、40bp和20bp。其中100bp、200bp、500bp的条带相对明亮，其他条带亮度由上至下逐渐减弱，可能原因有两个：①上方的条带