遗传学实验.

遗传学实验实验室安全守则•一般规定•1、上课第一天请先熟悉环境，察看紧急冲洗站、洗眼站、灭火器、急救箱及安全梯等的位置，牢记“安全”是进行任何实验最重要的准则。•2、在实验室內请穿着实验服，避免穿凉鞋、拖鞋。留有长发者，戴帽套将头发捲入套內，或以橡皮筋束于后，以防止引火危险或污染实验。•3、在实验室内禁止吸烟、饮食、化妆、嚼口香糖、嬉戏奔跑，食物饮料勿存放于实验室的冰箱中，实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服及杂物等。•4、所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有，不得带出实验室。每组分配的仪器、耗材请确定清点与保管，课程结束后如数清点缴回。公用仪器请善加爱惜使用，实验前后，请把工作区域清理擦拭，并随时保持环境卫生。•5、实验前详阅实验内容，了解实验细节的原理及操作规程，注意上课所告知的注意事项。实验进行中有任何状况或疑问，随时发问，切勿私自变更实验程序。打翻任何药品试剂及器皿时，请随即清理。实验后，确切记下自己的结果，严禁抄袭，确定关闭不用的电源、水、酒精灯及等。•6、实验完毕，请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关闭灯光及电源，离开实验室前记得洗手。•7、任何意外事件应立即报告师长，并应熟知相关的应急措施。实验目录1、减数分裂2、植物染色体压片法定性鉴定细胞核内脱氧核糖核酸的存在3、永久片的制作4、核型分析5、质量性状的遗传分析6、植物数量性状遗传分析7、蚕豆根尖细胞微核检测技术8、植物同源多倍体的人工诱发与鉴定1、了解动植物生殖细胞的形成过程；2、熟悉减数分裂各期特点；3、学习生殖细胞的取材和染色体制片实验一、减数分裂一实验目的二实验原理•减数分裂是一种特殊方式的细胞分裂，只发生在生殖细胞形成的过程中。减数分裂的特点是连续进行2次核分裂，而染色体只复制一次，从而形成4个只含单倍体数染色体的生殖细胞，经过受精后，合子中的染色体数目又恢复到2倍体水平，因此它是维持大多数动植物染色体数目世代稳定传递的根本机制。另一方面，基因的分离、自由组合以及交换也是通过减数分裂发生的，所以深入认识减数分裂对学习遗传学规律是非常重要的。•植物在花粉形成过程中，花药内的一些细胞分化成小孢子母细胞，即花粉母细胞（2n），每个花粉母细胞进行连续的2次细胞分裂，产生4个细胞，即具单倍体染色体数（n）小孢子或花粉。减数分裂中染包体的行为变化与生物的遗传变异密切相关。既然染色体是遗传物质的载体，因此染色体在减数分裂中的行为对遗传物质的分配和重组产生了重大影响。高等植物的性母细胞（2n）在形成雌雄配子（n）过程中必须通过减数分裂。•由于植物花药取材容易，操作和鉴定比较方便。故一般都取用花粉母细胞作为制片材料，在光学显微镜下观察其减数分裂过程中染色体的行为变化。三、实验材料蚕豆花蕾在早春（每年3-4月）蚕豆现蕾后，于上午8-10时，摘取长约lmm左右的花蕾，投入卡诺固定液（3V95%乙醇:1V冰乙酸），然后转入70%乙醇中，可保存2-3年）注：2n=１２，n=６四、实验用具药品•１仪器用具•显微镜、酒精灯、培养皿、载玻片，盖玻片、镊子、刀片、木夹、吸水纸、标签纸、火柴。•２药品试剂•醋酸洋红染色液（或丙酸一水合氯醛一铁矾一苏木精染色液）、卡诺氏固定液、95％酒精、80％酒精、70％酒精。•３染色液的配制:•1%醋酸洋红染色液的配制：将100ml45％醋酸加热煮沸后，移去火苗，徐徐加入1-2g洋红，待全部溶解后再煮沸1-2min，冷却后加入2％的铁矾水溶液5-10滴，或在煮沸醋酸洋红染色液中悬置数枚锈铁钉（防止溶液溢出），以增强染色性能。配制的染色液过滤后贮存于棕色试剂瓶中备用。•丙酸一水合氯醛一铁矾－苏木精染色液的配制：A液：称2g苏木精溶于l00ml50％丙酸中。B液：称0.5—1g铁矾溶于l00ml50％丙酸中。将A液和B液按1:1比例混合，每50ml混合液中加2g水合氯醛，存放一天后使用。1、取1-3枚花药放在洁净的载玻片上，用清洁刀片压在花药上向一端抹去，涂成薄层，然后滴1滴1%醋酸洋红染色液（或苏木精染色液），也可在花药上滴上染色液。然后用镊子把花药镊碎，去掉肉眼见得到的残渣，数分钟后盖上盖玻片，包被吸水纸，用大姆指匀力压片，或用铅笔的橡皮头垂直轻敲（加压时勿使盖片与载片滑动）。为了加深染色，可把载玻片平放在酒精灯火焰上来回摆动几次，使之略作加热。２、先在低倍镜下寻找花粉母细胞，一般花粉母细胞较大、圆形或扁圆形，细胞核大、着色较浅。而一些形状较小，整齐一致着色较深的细胞是药壁体细胞，一些形状处于中间略呈扇形的细胞是从四分体脱开后的小孢子或幼小花粉粒。如形状较大，内部较透明并具有明显外壳的细胞则是成熟的花粉粒。观察到有一定分裂相的花粉母细胞后，用高倍镜观察减数分裂各时期染色体的行为和特征。五、实验步骤减数分裂是形成性细胞时所进行的一种细胞分裂，染色体经过一次复制，细胞连续两次分裂，结果形成的子细胞的染色体数为母细胞的一半，由2n变为n。通过配子结合，染色体又恢复到2n。这样保证了有性生殖时染色体的恒定性，从而保证了生物上下代之间遗传物质的稳定性和连续性，也保证了物种的稳定性和连续性。另一方面，由于同源染色体分开，移向两极是随机的，加上同源染色体的交换，大大增加了配子的种类，从而增加了生物的变异性，提高了生物的适应性，为生物的发展进化提供了物质基础。图１－２减数分裂模式图六、实验作业1．制作减数分裂前期I图象清晰的片子1—2张。2．对所观察到的减数分裂各时期的图象进行绘图，并简要描述染色体的行为和特征。附：减数分裂各时期染色体的行为和特征•第一次分裂（2n→n）：•前期Ⅰ：可分为以下五个亚时期：•细线期：核内染色体呈细长线状，互相缠绕，难以辨别成双的染色体．•偶线期；同源染色体相互纵向靠拢配对，称为联会。这样联会的一对同源染色体，称为二价体。偶线期所表现的这一特征时间很短，一般较难观察到。•粗线期：配对后的染色体逐渐缩短变粗，含有两条姐妹染色单体，这样一个二价体中就包含了四条染色单体，故又称为四合体。在此期间各同源染色体的非姐妹染色单体间可能发生片段交换。•双线期：各对同源染色体开始分开，由于在粗线期非姐妹染色单体之间发生了交换，因而同源染色体在一定区段间出现交叉结。此期可清楚地观察到交叉现象。•终变期（浓缩期）：染色体更为浓缩粗短，交叉结向二价体的两端移动，核仁和核膜开始消失，此时各二价体分散在核内，适于计数染色体的数目。•中期Ⅰ：核仁和核膜消失，所有二价体排列在赤道板两侧，细胞质里出现纺锤体，每个二价体的两条染色体的着丝点分别趋向纺锤体的两极，此时最适于计数染色体的数目和观察各染色体的形态特征。•后期Ⅰ：二价体中的一对同源染色体开始分开，在纺锤体的作用下分别向两极移动，完成染色体数目的减半过程。此期，同源染色体的两个成员必然分离，非同源染色体间的各个成员以同等机会随机结合，分别移向两极。注意此时染色体的着丝点尚未分裂，每条分裂，在赤道板处形成细胞板，成为二分体。•末期Ⅰ：染色体到达细胞两极后逐渐解旋。核仁、核膜重新出现、在赤道面形成新的细胞板，1个性母细胞分裂为2个子细胞。每个子细胞中含有单倍的染色体（n）•第二次分裂（n→n）：•前期Ⅱ：染色体又开始明显缩短，而其包含的两条染色单体分得很开，只是着丝点仍然没有分裂。•中期Ⅱ：染色体整齐地排列在分裂细胞的赤道板上，出现纺锤丝。•后期Ⅱ：染色体的着丝点分裂为二，两条姐妹染色单体在纺锤丝的牵引下分别移向两极。•末期Ⅱ：染色体分到两极后，又重新出现核仁和核膜，同时细胞质分隔为二，从而使一个母细胞分裂成为四个子细胞，称为四分体或四分孢子。每个子细胞内只含有原来母细胞的半数的染色体（n）。实验二、植物染色体压片法定性鉴定细胞核内脱氧核糖核酸的存在•一、实验目的•学习应用孚尔根染色法，定性鉴定细胞核内脱氧核糖核酸（DNA）的存在．•掌握染色体制片方法，观察染色体动态变化。实验说明•具有自我复制能力是生命的一个基本特征。单细胞生物可以通过细胞分裂直接复制自身，而多细胞生物从受精卵开始，经过有丝分裂使细胞不断增殖并经过一系列复杂的分化过程形成新一代个体。•一般来说，只要能够进行细胞分裂的植物组织或是单个细胞都可以作为观察染色体的材料。如植物的顶端分生组织（根尖或茎尖）、居间分生组织（禾本科植物的幼茎及叶壳）、愈伤组织和胚乳、萌发的花粉管等，在这些组织内不断进行着细胞分裂。只要适时取材，并加以固定、离析、染色等处理后制成染色体玻片标本，即可利用显微镜对有丝分裂和染色体进行观察。•这是细胞遗传学最基本和常用的方法，在物种亲缘关系鉴定、染色体变异、杂种分析等工作中有着广泛的用途。二、实验原理•孚尔根（Feulgen）染色法是鉴别细胞核中DNA的组织化学方法，其原理与希夫试剂的化学性质有关。希夫试剂是由碱性品红与亚硫酸氢钠和盐酸作用而生成的，为无色透明的溶液，它遇醛类物质即呈紫红色，故可用于鉴定醛基的存在。DNA分子结构中本身无醛基，但在60ºC1M盐酸的水解作用下，部分地打断DNA分子中脱氧核糖与嘌呤间的糖苷键，使嘌呤碱基脱落，并在脱氧核糖的第一个碳原子上释放出活性醛基，该基团遇希夫试剂即呈紫红色。在细胞内只有DNA才具有这种反应，故可定性地鉴定细胞核内DNA的存在。这一染色方法是Feulgen和Rossenbeck于1924年首先发现和确定的，故称孚尔根染色法。三、实验材料•洋葱（Alliumcepa，2＝16）的根尖四、实验用具药品•(一)仪器用具显微镜、恒温水浴锅、试管、载玻片、盖玻片，镊子、刀片、吸水纸。•（二）药品试剂碱性品红、亚硫酸氢钠、活性炭、1M盐酸，45％醋酸，１％秋水仙素。希夫试剂的配制方法：•将0.5g碱性品红徐徐加入煮沸的100ml蒸馏水中，用玻璃棒搅拌，使之充分溶解，待溶液冷却至58C左右，过滤于棕色瓶中。当滤液冷却至26C时，再加入10ml的1M盐酸和0.5g亚硫酸氢钠，摇动，溶解后密封于棕色瓶中，置于黑暗低温处。次日检查溶液颜色，须呈无色透明或淡茶色才可使用。若稍呈红色可加入0.5g活性炭连续摇动，在4C下静置过夜，然后过滤脱色。漂洗液的配制方法•将5ml1M盐酸和5ml10％亚硫酸氢钠溶液分别倒入容量瓶中，再用蒸馏水定容至100ml。五、实验步骤•1.材料培养:洋葱根尖：将通过休眠的洋葱鳞茎搁置在盛满清水的烧杯上，在室温下（25C左右）发根，待根长至1-1.5cm时，进行前处理。•2.前处理：剪下根，用0.05%秋水仙碱浸泡2-3小时。•3.固定：将根尖用乙醇-冰乙酸（3：1）固定液固定4-24小时，以后转入70%乙醇中冰箱保存。•4.酸解：(注意酸的浓度、温度、时间与水温有反相关系）。试管1：取洋葱根尖数条水洗2次，投入试管，加入数滴1M盐酸浸没根尖，在60C下水解10min，待幼根软化（同时变为半透明），取出用蒸馏水换洗2次。试管2（对照）：另取洋葱根尖数条水洗2次，投入试管，加蒸馏水数滴浸没根尖，在60C下处理10min，然后把蒸馏水倒去。以下各步骤两试管相同。•5.染色:两试管中均滴加希夫试剂，浸没根尖，立即置于暗处处理0.5-1h，然后用漂洗液换洗3次，每次2min；再用蒸馏水换洗2次，每次2min。•6.压片镜检:分别取上述两试管中的根尖，置于载玻片上，滴1滴45％醋酸，然后压片镜检。•将根尖放在载片中央，切取根尖部分，滴上一滴滴1滴45％醋酸，并盖上盖玻片。酸解良好的材料，只要用镊子尖轻轻地敲打盖片，分生组织细胞就可铺展成薄薄的一层，再用吸水纸把多余的酸液吸掉，经显微镜镜检后，选择理想的分裂细胞，再在这个细胞附近轻轻敲打，使重叠的染色体渐渐分散，就能得到理想的分裂相，必须掌握以下2点：•1）压片材料要少，避免细胞紧贴在一起，致使细胞和染色体没有伸展的余地；•2）用镊子敲打盖片时，用力要均匀，若在压片时不注意，使个别染色体丢失，而被迫放弃一个良好的分裂相的细胞。六、实验作业1、分别制作经孚尔根染色和对照处理的临时片2张，并根据镜检结果绘图。•2、比较根尖经盐酸水解处理与否所获得的结果，并作出解释。•３、将分裂中期效果好的玻片用石蜡进行临时封片，贴上标签，低温保存