转染详细步骤大攻略

转染详细步骤大攻略范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/µl。将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。具体操作步骤如下：1）质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下：(1)取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1min,尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA）,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。（注：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低）(3)向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。（注：混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏）(4)向离心管中加入250µl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。（注：溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清）(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min至溶液变清亮。(6)37℃水浴5min，不时振荡，溶液又变浑浊。12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。(7)将质粒DNA上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相，重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。(8)加入600µl结合液，充分混匀后加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min,倒掉收集管中得废液。（如果一次加不完可分两次加）(9)向吸附柱中加入700µl漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1min,弃废液，将吸附柱放回收集管中。(10)向吸附柱中加入500µl漂洗液，12000rpm离心1min,弃废液，将吸附柱放回收集管中。(11)12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中得乙醇会影响后续实验如酶切、PCR等。（12）将吸附柱放入一干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50µl-200µl经65℃水浴预热的无内毒素洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心1min。（12）为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置5min，12000rpm离心1min。将得到的去内毒素的真核表达质粒测定质粒浓度，分装标记后，4℃保存备用。2)细胞培养与接种将A549细胞培养于含10%胎牛血清FBS、含双抗（100U/ml青霉素和100µg/ml链霉素）的1640(Solarbio)培养基中,于37℃、5%CO3培养箱中培养。待细胞密度大约70%-80%时，吸去培养瓶内的旧培养液。用无菌PBS缓冲液（0.4gKCl，0.4gKH2PO4，16gNaCl，3.12gNa2HPO4﹒7H2O，融解在2L双蒸水中）漂洗细胞两次，吸去漂洗液。将1mL胰酶（37℃水浴）加入培养瓶中，消化2-5min于显微镜下观察至细胞变圆后倒掉，吸去残留胰酶，加入3ml完全培养基，轻轻吹打瓶壁细胞（尽量避免大量气泡产生），使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。用移液枪吸取100ul吹打后的细胞悬液于EP管中，加入900ul培养基与之混合，混合均匀后取10ul沿盖玻片的边缘滴加到细胞计数板上，置于显微镜下观察并计算细胞接种密度。铺板后置于显微镜下观察，轻轻晃动培养板使之细胞分散均匀，室温放置片刻放入培养箱中培养。3)细胞转染以下转染操作以12孔板为例。转染全过程于细胞间严格无菌操作。(1)转染前一天，胰酶消化细胞并计数（使其在大约24小时后转染前密度达到90%左右为宜），将细胞铺板在1ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。(2)对于每孔细胞，使用100μl无血清培养基（1640基础培养基）稀释1.6μg质粒，轻轻混匀后于室温放置5min。(3)对于每孔细胞，使用100μl无血清培养基（1640基础培养基）稀释4μlLipofectamine2000试剂。轻轻混匀后于室温放置5min。(4)将步骤2和步骤3的溶液混合，轻轻混匀后于室温静置20min。(5)同时，将12孔板中的细胞用PBS冲洗细胞一遍后，再用无血清培养基（1640基础培养基）冲洗一遍后，加入1ml无血清培养基。(6)将步骤4的复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。置于37℃，5%CO2培养箱中培养6h。(7)6h后，将无血清培养基更换为含有血清的培养基（即10%胎牛血清+90%1640基础培养基），继续孵育24－96小时于荧光显微镜下检测结果。他山之石：昨天做了一次转染，用的是英俊的脂质体2000转染试剂（刚买不到3个月），转染成纤维细胞（通过原代分离培养的，但是不是很纯有其他细胞），6孔板细胞量，转EGFP质粒（质粒没有问题，因为在别的细胞转染试过好用），按照说明书的比例质粒加4微克，转染试剂加10微升，转染复合物共500微升，孵育20分钟后，加到用PBS清洗两遍的6孔板中，补加500微升无血清和双抗的DMEM培养基，37°二氧化碳培养箱培养，5小时换液时发现：许多细胞出现严重的凋亡现象，细胞呈扁平放射状，放射的突出有分叉，像树枝一样，看样子像是死了！不知道细胞还能不能活过来，所以5小时换液换成含血清不含双抗的DMEM培养基过夜培养，结果今天早上发现细胞全死了！太伤心了！以前也做过这种转染，有时也会出现细胞死的很严重的现象，有时就很好，曾经尝试在4-6小时转染的过程中加少量的血清，但作用好像不大!是不是我的细胞有问题呢？请各位高手帮我分析一下原因呗谢谢了！可能细胞有差异吧，我也用lip2000转染的，5小时以后换不含抗生素的DMEM，细胞状态很好，元代细胞比较娇嫩谢谢kiss9499的回答！你用的也是lip2000的比例转染的吗？我想问下转染细胞效率怎么样呢？我以前转染成功过，但是效率不是很高！谢谢！好像lipo的说明书中不建议使用含抗生素的培养液。专门找了一下，是不能用含抗生素的培养液，会导致细胞死亡。我现在是连正常培养的细胞都没有加，注意无菌操作就行了。要求转染过程中无血清、无抗生素。不知道转入的基因是否会引起细胞调亡。另外建议降低lipfectamin的浓度试试看，我们研究室很多人都不用说明书推荐的用量的，经常是推荐用量的1／4。用量高，细胞毒性也高，细胞容易死。我也遇到过此类情况，用量改为1／4就ok啦。抗生素我们倒是不太在意，转染的时候不加，但是5个小时换液后培养一直都加的，没啥关系。我转过的成纤维细胞是3T3，不知道是不是我的目的基因问题，用说明书用量细胞会死，但是用1／4的话完全顺利进行。还有转染时的细胞密度不要太低，否则会引起细胞死亡。兄弟，在转染之前最好是用无抗生素的培养基培养12小时，然后再进行转染。谢谢大家的回答，在此十分感谢！我看到有的帖子说原代的细胞对血清很敏感，是不是转染过程中（尤其是4-6小时）会造成细胞死亡呢！我以前用过PK15细胞做转染对照试验，一个在4-6小时转染过程中加血清，一个不加，结果发现细胞都很好，而且转染效率也没有差别，至少证明在这种细胞中加不加血清不会影响转染效率，但对于原代的成纤维细胞，我就不知道应不应该在转染过程中加血清了！好像在园子里看到过，一位老兄的原代细胞转染，他是给的5%的血清，细胞状态还好。可以试试啊！按照lipo的说明书，血清的影响应该不是很大。但是转染过程中抗生素是必须去除的。Lipo2000,6孔板推荐使用量是10ul。但不同细胞对lipo和质粒的耐受不同，我们一般减半使用两者，即使这样肿瘤细胞还是死亡不少，更何况你的细胞是正常细胞株，耐受力肯定没有肿瘤细胞大。建议使用不同的lipo浓度，如推荐量的1/2或1/4等，观察转染效率，选择效率好，细胞死亡少的量。血清对转染质粒影响不大，如果不用，可能会提高转染效率。同意楼上：转染过程中抗生素是必须去除的。如果质粒的转染效率还行，可以减少lipo的加入量，另外，先在孔板中加入培养液，再一滴滴缓慢分散加入lipo可以减少细胞的死亡。问题一：已经讨论过了，转染前48小时一定不可用抗生素。问题二：转染时要求细胞状态非常好，细胞要经受lipo2000的毒性和外源基因导入双重打击。问题三：稀释质粒和lipo2000需要OPTIMEM，同时还要用1mlOPTIMEM去铺底尽量不要用DMEM。问题四：转染过程必须无血清，4-6小时候方可换全培另外转染混合物要充分混匀。我最近也在做鸡胚成纤维细胞的转染，也遇到这样的问题，我用的是24空板，细胞传到第三代时转染，但一加脂质体细胞就明显出现死亡，到48小时时测荧光，结果转染效率很低，只有几个光点，请问各位该怎么解决呢？也查了资料，说原代细胞对血清的依赖挺大的，转染时可用低浓度的完全培养基，如5%。但我有另外一个问题，就是24孔板里，目的质粒和脂质体的具体用量到底怎样最好呢？各位大虾您们好！我是园内的新手，但从园内学到许多知识。我想请问：我转染PGEFP进入真核细胞后24小时观察转染效率80％，细胞状态尚好，但到48小时细胞大量死亡，请高手指点，多谢！我转染的质粒提取良好OD:1.8;质粒与脂质体比1：1和1：2，细胞未见污染；严格按照脂质体说明进行，转染6小时换DMEM+FBS