邻苯二酚类化合物的合成及作为核酸交联剂的生物活性研究

1邻苯二酚类化合物的合成及作为核酸交联剂的生物活性研究（武汉大学化学与分子科学学院武汉430072）摘要：本实验合成了两个邻苯二酚类化合物，分别检测它们对不同二级结构核酸的交联活性。实验的活性检测部分既包含对双链核酸的交联活性检测，又包含对G-四链体的交联活性检测，分别通过琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳监测其交联活性。最后用圆二色谱测G-四链体的半解链温度，并用MBTH显色反应证实邻苯二醌中间体的产生，进一步证实了交联的发生。关键词：邻苯二酚类核酸交联剂0引言交联具有重要的生物学意义。组成DNA长链的碱基，糖环和磷酸基团中含有大量的富电子的N，P原子，O，这些原子容易受到亲电试剂的进攻。利用这一点，在特定的药物小分子上接上亲电基团，这些亲电基团进攻富含电子的N，O，P原子从而生成稳定的共价键。从而改变了DNA的结构组成，达到阻碍DNA复制和转录的目的。这样的过程被称为DNA的烷基化。而这些小分子就被称为DNA的烷基化试剂。有很多研究表明，在生物体中的DNA的被烷基化后，生物体会有一个自生修复的机制。被烷基化的DNA可以通过生物体内的DNA修复酶得到部分修复。使得这样的DNA损伤不至于影响到生物体内遗传信息的传递和细胞的死亡。但是如果药物分子带的烷基化基团增多，对DNA双链烷基化效果更好，也就使DNA修复酶对DNA的修复作用变弱。通常我们把这些带有两个或者以上的烷基化试剂叫做DNA的交联剂。EcoRI是Ⅱ型限制性内切酶[1]，EcoRI以同型二聚体作用，两个EcoRI分子沿着DNA识别序列的相对方向排列，进入DNA分子内部对碱基发挥作用。EcoRI分子内部特异性氨基酸与DNA识别序列GAATTC形成氢键。一旦结合，限制酶内部的其他残基催化水解反应，利用水破坏识别序列内部DNA双链中每条链的磷酸二酯键[2]。本实验将其用作对pBR322质粒DNA进行酶切，得到线性的DNA分子有利于通过凝胶电泳研究化合物的交联模式。邻苯二酚是苯的两个邻位氢被羟基取代后形成的化合物。在氧化剂氧化条件下生成邻苯二醌活性中间体，它可以与碱基发生化学反应，即烷基化作用，两个位点的烷基化作用也就形成所谓的核酸交联。本实验将合成两个邻苯二酚类化合物，以酪氨酸酶为氧化剂分别检测它们对不同二级结构核酸的交联活性。G-四链体，是由4个鸟嘌呤作为基础发生交互作用结合成为一个正方形，它们是一种暂时性结构，大量存在于即将分裂的细胞之中，它们出现在染色体核和染色体终端(可以保护染色体免受损害)。由于癌细胞分裂非常迅速，在染色体终端经常出现缺陷，四重螺旋体DNA分子可能唯一存在于癌细胞。酪氨酸酶被称为多酚氧化酶，被指出和某些疾病以及肿瘤有关。酪氨酸酶在恶性肿瘤黑素瘤细胞中高表达。酪氨酸酶能氧化诱导邻苯二酚类化合物得到高活性的邻苯二醌中间体，从而与DNA进行交联。本实验设计的化合物主要针对核酸G-四链体，拟实现对这种特殊核酸二级结构的选择性交联，并通过酪氨酸酶的酶诱导，实现对癌细胞的特异性作用，以减小药物的毒副作用。因此实验的活性检测部分既包含对双链核酸的交联活性检测，又包含对G-四链体的交联活性检测。21实验部分1.1试剂与仪器1)试剂邻苯二胺（A.R），对苯二胺(A.R)，3，4-二羟基苯甲醛，3MpH5.2NaOAc，乙醇，DMSO，琼脂糖，去离子甲酰胺，MBTH，Tris-HCl（100mMpH7.0），10×碱性电泳液（500mMNaOH，10mMEDTA），中和溶液(1MTrispH=7.6和1.5MNaCl溶液)，6×LordingBuffer（300mMNaOH，6mMEDTA，18%m/VFicoll-400，0.15%溴甲酚绿，0.25%二甲苯氰），GelRed染色剂（10000×，使用是用0.1MNaCl稀释），40mL，20%变性聚丙烯酰胺凝胶：40%，19：1丙烯酰胺20mL，5×TBE缓冲液（54gTris碱，27.2g硼酸，20mL0.5mol/LEDTA）8mL，尿素16.8g，10%过硫酸铵360μL，TEMED40μL。[3]pBR322质粒DNA，LambdaHindIIImarker，EcoRI限制性内切酶，酪氨酸酶，荧光标记的Pu27序列。2)仪器加热磁力搅拌器，PHS—3C型精密pH计，电热恒温水浴箱，台式离心机。微型混合器琼脂糖水平电泳槽，微波炉，稳压稳流电泳仪，凝胶成像分析系统，小型垂直电泳槽，烘箱，圆二色谱仪1.2实验步骤1.2.1邻苯二酚类化合物的合成合成路线：[4]化合物一：化合物二a．邻苯二甲胺类化合物称取10mmol3，4-二羟基苯甲醛于两口圆底烧瓶中，用5.3mL乙醇溶解。称取5mmol邻苯二甲胺于烧杯中，加入5.0mL乙醇用超声完全溶解。将邻苯二胺溶液慢慢滴加到3，4-二羟基苯甲醛溶液中，加入磁子，开启磁3力搅拌，在135°C下搅拌回流4h。反应完全后，得棕色溶液，直接抽滤，用乙醚洗涤3次后收集沉淀。b．对苯二甲胺类化合物称取10mmol3，4-二羟基苯甲醛0.69g于两口圆底烧瓶中，用5.0ml乙醇溶解。称取5mmol对苯二甲胺于烧杯中，加入5.0mL乙醇用超声完全溶解。将对苯二胺溶液慢慢滴加到3，4-二羟基苯甲醛溶液中，加入磁子，开启磁力搅拌，在140°C下搅拌回流4h。反应完全后，得黄色溶液，直接抽滤，用乙醚洗涤3次后收集沉淀在红外灯下干燥半小时得棕色粉末。称量得1.91g。1.2.2质粒pBR322的酶切及沉淀、定量在1.5mL的EP管中依次加入超螺旋质粒pBR322DNA(10μL，10μg)，含有EcoRI缓冲溶液(10x，20μL)以及乙酰化牛血清白蛋白(BSA，20μL，1mg/mL)溶液，振荡混匀溶液之后，随即加入EcoRI(10μL，32-80u)进行酶切反应，整个反应体系在37°C下反应2小时左右。用试剂盒沉淀DNA后用紫外定量，为173ng/μL，放置在-20°C冰箱中储存待用。1.2.3邻苯二酚类化合物对线型DNA的交联活性检测分别取10mg化合物1和2配成10mM的DMSO溶液，稀释成100μM和500μM的溶液备用。按下表在0.5mLEP管中分别配置成20μL的体系：化合物1化合物2DNATris-HCl(100mM,pH7)酶H2O1005μL2μL4μL9μL22μL（100μM）05μL2μL4μL7μL32μL（500μM）05μL2μL4μL7μL402μL（100μM）5μL2μL4μL7μL502μL（500μM）5μL2μL4μL7μL表1.邻苯二酚类化合物对线型DNA反应体系各化合物浓度表将上述样品放入37℃恒温水浴中反应1h。制备1%的琼脂糖凝胶：将1g琼脂糖粉末用100mL碱性电泳溶胶溶液在微波4炉中加热溶解，其中加入10μLGelRed溶液，待溶液的温度稍冷，随即将溶液倒入做胶的池子中冷却固化，1小时后把配制好的带有胶孔的凝胶放入碱性电泳缓冲溶液中，加入的缓冲溶液要将胶全部浸没。[5]向化合物与DNA反应体系中加入4μL6×LoadingBuffer，从左至右分别加入DNAmarker和样品1，2，3，4，5。在3V/cm的固定电压条件下电泳2.5小时。电泳完成后用凝胶成像仪进行照胶。1.2.4邻苯二酚类化合物对G-四链体DNA的交联活性检测按下表在0.5mLEP管中分别配置成10μL的体系：123456TAMRA-pu27111111化合物-邻00.50.5000化合物-对0000.50.50DMSO0.500000酶222222ddH2O5.55.55.55.55.56Tris-HCl+buffer(10×)111111加样顺序ddH2O→Tris-HCl+buffer(10×)→pu27DNA→化合物/DMSO→混匀→酶→混匀→37℃1h聚丙烯酰胺凝胶的配制：本实验用的是20%变性聚丙烯酰胺凝胶，其配方为：40mL凝胶溶液:40%19:1丙烯酰胺20ml5×TBE8ml尿素16.8g10%过硫酸360LTEMED40L胶凝后用电泳液将梳孔内尿素吹净，预电泳30min，将化合物与DNA反应后的体系中加入10L去离子甲酰胺，混合均匀后上样。160v电压下电泳3小时。电泳结束后用激光扫描仪成像。2结果与讨论2.1结果52.1.1邻苯二酚类化合物对线型DNA的交联活性检测结果图12.1.2邻苯二酚类化合物对G-四链体DNA的交联活性检测结果图22.2讨论2.2.1邻苯二酚类化合物对线型DNA的交联活性检测结果分析可能是由于酶切时缓冲溶液加错，使得DNA分解，所以没有明显的成像。2.2.2邻苯二酚类化合物对G-四链体DNA的交联活性检测结果分析图像中未见明显交联，可能是由于酶不太稳定，失去活性。3结论本实验通过合成两个邻苯二酚类化合物，以酪氨酸酶为氧化剂分别检测它们对不同二级结构核酸的交联活性。在凝胶电泳中发现化合物对G-四链体结构未能较好交联。4感谢感谢武汉大学化学与分子科学学院综合实验中心提供的大力支持与帮助，感谢指导老师田沺老师的指导，感谢同组同学的合作！参考文献：[1]黄[1]张楚富.生物化学原理（第2版）[M].北京：高等教育出版社，2011.156-157.Zhangchufu.PrinciplesofBiochemistry(2ndEd)[M].Beijing:HigherEducationPress,2011.156-157(Ch).[2]MicklosD.A,FreyerG.A.DNAScienceAFirstCourse(2ndEd)[M].ColdSpringHarborLaboratoryPress,2003.112-113.[3]张维铭.现代分子生物学实验手册（第1版）[M]北京：科学出版社，2003.122-124.Zhangweiming.ModernMolecμLarBiologyLaboratoryManual(1stEd)[M]Beijing:SciencePress，2003.122-124(Ch).[4]Yuan,L.;Tian,T.;Chen,Y.;Yan,S.;Xing,X.;Zhang,Z.;Zhai,Q.;Xu,L.;Wang,S.;Weng,X.;Yuan,B.;6Feng,Y.;Zhou,X.ExistenceofG-quadruplexstructuresinpromoterregionofoncogenesconfirmedbyG-quadruplexDNAcross-linkingstrategy[J].ScientificReports2013,doi:10.1038/srep01811.[5]赵亚力，马学斌，韩为东.分子生物学基本实验技术（第1版）[M]北京：清华大学出版社，2005.98-100.Zhaoyali,Maxuebin,Hanweidong.BasicMolecμLarBiologyExperimentTechnique(1stEd)[M]Beijing:TsinghuaPress，2005.98-100(Ch).SynthesisofCatecholCompoundsandBiologicalStudiesofInducibleDNACross-LinkingAgentsZHANGWei(CollegeofChemistryandmolecularsciences,WuhanUniversity,Wuhan430072,China)Abstract:TwokindofcatecholcompoundsforuseofDNACross-LinkingAgentswassynthesizedandtheactivityofcross-linkingtoDNAofdifferentsecondarystructureweredetected.ThedetectionofactivityconsistsoflinearDNAcross-linkingthroughagarosegelelectrophoresisandG-quadruplexcross-linkingth