生化分离工程_苏海佳_第三章细胞破碎

Chapter3CellDisruption第三章细胞破碎微生物的代谢产物多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，氨基酸等目标产物存在于在发酵液中。有些目标产物存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的多数蛋白质不会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积。脂类和一些抗生素也是包含在生物体中。目标产物就是细胞本身，如面包酵母。胞外胞内细胞细胞破碎是指：选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。胞外物质胞内物质发酵液预处理——澄清液收集菌体——细胞破碎——转入液相——碎片分离主要划分为两大类:化学法和机械法3·1细胞壁结构和化学组成1.细菌的细胞壁所有的细菌细胞壁由坚固的骨架——肽聚糖组成1、肽聚糖由聚糖链借短肽交联而成，网状结构，使细胞有一定的形状和强度；2、短肽一般由4-5个氨基酸组成，常含有D-氨基酸与二氨基庚二酸；3、聚糖链由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸交替通过（1-4）糖苷健连接而成。短肽接在N-胞壁酸上，相邻的短肽交叉相连，形成网状。所有细菌都含有肽聚糖的网状结构。革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，约15-50nm，肽聚糖含量占40%一90%。其余是多糖和磷壁酸；革兰氏阴性菌的肽聚糖层约1.5-2.0nm，外有一外壁层约8-l0nm，由脂蛋白和脂多糖及磷脂构成的两层外壁层。革兰氏阳性菌的细胞壁比革兰氏阴性菌坚固，较难破碎。特点：破碎阻力：肽聚糖的网状结构网结构的致密程度和强度，与肽键的数量和交联度有关。Gram-negativeprocaryotes革兰氏阴性原核生物（E.coli）1、里层葡聚糖的细纤维——细胞壁的刚性骨架；2、覆盖在细纤维上的是一层糖蛋白；3、外层是由1，6—磷酸二脂键共价连接而成的网状结构的甘露聚糖；4、其内部有甘露聚糖—酶的复合物。2、酵母的细胞壁组成：由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质构成，比革兰氏阳性菌的细胞壁厚，更难破碎。例如，面包酵母的细胞壁厚约70nm。特点：破壁阻力：壁结构交联的紧密程度和壁厚。植物细胞壁的主要组成成分是纤维素在初生壁上还有半纤维素和果胶质纤维素是由链状结构的-D-葡萄糖以1，4-葡萄糖苷键结合，纤维素分子束聚集——微纤丝——植物细胞壁的框架，而其他物质填充在微纤丝之间的空隙中——植物细胞壁的基本结构。在干燥植物体中纤维素约占总重的1/3一1/2。就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏(增大通透性)或破碎，释放其中的目标产物。细胞的大小，形状、聚合物的交联程度破碎细胞的目的影响破碎的因素：※3.2细胞破碎和产物释放原理利用化学、生化试剂或酶改变细胞壁或细胞膜的结构，增大胞内物质的溶解速率，或完全溶解细胞壁，形成原生质体，在渗透压作用下，细胞膜破裂释放胞内物质。化学法压缩力和剪切力——高压匀浆、珠磨、撞击破碎、超声波破碎机械法主要有：酸碱处理、化学试剂处理、酶溶渗透压冲击法和冻结—融化法物理渗透法细胞破碎机理※3.3mechanicaldisruption机械破碎1、处理量大，破碎快，时间短，效率较高，工业规模的重要手段；2、作用力：挤压，剪切和撞击作用；3、在许多情况下，细胞内含物全部释放出来；4、由于机械搅拌产生热量，破碎要采用冷却措施。机械法破碎特点机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法和超声波等方法。1.高压匀浆法（high-pressurehomogenization）原理：利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速撞击造成细胞破裂，在高压匀浆器中，细胞经历了高速造成的剪切、碰撞和由高压到常压的突变，从而造成细胞壁的破坏，细胞膜随之破裂，胞内产物得到释放。高速匀浆破碎的动力学方程为：baSnNPkl11细胞破碎率S与操作压力P和循环次数N之间的关系。k为破碎速度常数上述参数随微生物种类和培养条件的不同而有所差异压力P可用动能表达：baSnNukl)2(211影响因素：细胞破碎率用包内产物释放率表示：maxRRS1、压力、温度和通过匀浆器阀的次数，操作压力影响最大。工业生产中常采用的压力为55－70Mpa。2、不同菌种，不同生长期以及不同培养条件。优点：1、操作参数少，且易于确定；2、样品损失量少，在间歇处理少量样品方面效果好3、适用于酵母和大多数细胞的破碎。适用范围：1、适用于酵母和大多数细菌细胞；2、细胞浓度可达20%；3、团状或丝状真菌易造成堵塞，一些易损伤匀浆阀，质地坚硬的亚细胞器一般不适用；4、需设置冷却装置。原理：细胞悬浮液与玻璃珠（或石英砂，或氧化铝）一起高速搅拌，研磨使细胞达到某种程度破碎，2.珠磨法（Beadmilling）作用力：剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动WSK卧式高效全能珠磨机ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机两种情况下，细胞破碎动力学可近似表示为：tklSn11QVtt：为细胞悬浮液在破碎室内的平均停留时间其中V为悬浮液体积m3，Q为悬浮液流量m3/S，S为破碎率，k为破碎速率常数，与许多因素有关。可采用间歇式与连续操作。间歇操作：t为破碎操作时间即连续操作：1、随细胞种类而异；2、同一进料速度，细胞浓度，则破碎率，能耗；3、同一悬浮液中，破碎的能耗与破碎率成正比，提高破碎率，导致电能消耗增加；4、对一定细胞，存在适宜的微球粒径，通常D/d=30-100，D：微球粒径；d：目标细胞粒径。搅拌转速悬浮液进料速率微球大小微球填充密度细胞浓度微球密度温度搅拌桨设计破碎室的几何形状影响1、操作简便稳定，破碎率可控制，易放大2、在实验室和工业规模上已得到应用3、适用于绝大多数微生物细胞破碎，特别对于有大量菌丝体的微生物和一些有亚细胞器（质地坚硬）的微生物细胞。缺点：破碎过程产生大量的热能，有效能量利用率仅为1%，应充分考虑换热。优点：3、撞击破碎原理：将细胞冷冻可使其成为刚性球体，降低破碎的难度。如图：细胞悬浮液以喷雾状高速冻结，形成粒径小于50m的微粒子。高速载气(如氮气，流速约300m/s)。将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破碎。1、细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬间，细胞破碎均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎的现象。2、细胞破碎程度可通过无级调节载气压力(流速)控制，避免细胞内部结构的破坏，适用于细胞器(如线粒体、叶绿体等)的回收。3、适用于大多数微生物细胞和植物细胞的破碎，通常处理细胞悬浮液浓度为10%-20%。4、实验室规模的撞击破碎器间歇处理能力约50-500cm3，而工业规模的连续处理在l0dm3/h以上.特点：4、超声波破碎法(Ultrasonication)破碎机理：是与空化现象引起的冲击波和剪切力有关，即空穴作用产生的空穴泡由于又受到超声波的冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击力压力，由此而引起悬浮细胞上产生了剪切应使细胞内液体产生流动而使细胞破碎。空化作用机械作用热效应1、处理少量样品时操作方便，液体损伤量少，破碎率高。2、有效能量利率极低，操作时需在冰水中进行或通入冷却剂而增加成本，不易放大；3、适用于大多数微生物的破碎，不适于大规模操作，主要用于实验室规模的细胞破碎。影响：细胞种类、浓度、处理时间以及超声波的声频特点：方法技术原理效果成本举例机械法研磨法细胞被研磨物磨碎适中便宜超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎适中昂贵细胞悬浮液小规模处理匀浆法（孔型）须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎剧烈适中细胞悬浮液大规模处理珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理细胞机械破碎法比较※3.4CHEMICALMETHODS化学方法1.碱处理利用酸碱调节pH值，可提高目标产物溶解度。pH=11.5-12.5碱处理20－30min可导致细胞溶解。缺点：pH=11－11.5的碱浓度破坏了许多生物活性，使蛋白酶失活，常伴随着蛋白的变性和降解。优点：价格便宜，易适于任何规模的操作。2.化学试剂法化学渗透取决于试剂的类型和细胞壁、细胞膜的结构与形成。1).EDTA螯合剂，对细胞的外层膜有破坏作用。如E-coli；原因：二价阳离子，尤其是Mg2＋对革兰氏阴性菌细胞被膜以外层膜的稳定作用是重要的，EDTA的螯合作用导致外层膜不稳定或去除。2).有机溶剂法可使细胞膜表面发生变化，胞内产物可以释放出来，由于没有整体破碎细胞，可实现选择性释放.如采用异丙醇处理酵母，释放超氧化物歧化酶，处理后，超氧化物歧化酶释放率达90％，纯化因子提高25。3).表面活性剂能够作用细胞质和细胞壁膜，膜结构中的脂蛋白成分被或多或少地溶解，使细胞渗透作用有利于某些蛋白的通过。如：SDS等作用是溶解蛋白质和扰乱蛋白－脂界面。化学渗透法的优点：避免大量细胞碎片，核酸留在胞内，处理后，溶液很容易澄清，简化后处理步骤，简单的搅拌容器代替了机械破碎设备。缺点是价格昂贵，易污染产物，会导致产物活性和最优产量的不可逆损失。3.生物法酶溶法是利用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的键而达到破壁的目的，以提高胞内产物和通透性。优点：生物转移性强，操作条件温和、能量低、可避免高剪切力，确保产物破坏最小。缺点：费用高，时间长，多用于原生质体自溶作用是酶溶的另一种方式，通过调节温度，PH或添加有机溶剂等激活剂，诱使细胞产生溶解自身的酶的方法，称为自溶。1）渗透压冲击法（OsmoticShock）将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速通过细胞壁和细胞膜进入细胞，引起细胞壁和膜膨胀破裂，从而使细胞通透性增大。4.细胞物理破碎方法原理1、最温和的一种方法2、选择性高，释放速度快，工艺简单，易放大。3、适用于易破碎的细胞，和细胞壁预先受到酶处理的细胞，及合成受抑制而强度减弱的细胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌。特点：缺点：存在着高盐浓度对产品污染问题。2)冷冻－融化法(Freczinganthawirg)破坏细胞膜的疏水键，增加其亲水性和通透性，而且由于胞内水结晶使胞内外产生溶液浓度差，在渗透压作用下引起细胞膨胀而破裂。本法对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较为有效，但由于本法成本高，只能进行小规模应用，且释放速率慢、产量低，另外酶易失活也限制了它的更进一步利用。通过水结晶的形成和随后的融化而进行细胞破碎。原理冷冻的目的缺点5.胞内产物的选择性释放细胞完全破碎的缺点：所有胞内的蛋白质全部释放出来，粘度增加，杂质增加，给后面分离纯化带来困难。1、目标：细胞不完全破碎，选择性释放，其他物质尽量少释放，粗分。生化集成：利用两种以上的不同阶段的分离过程同时进行。2、原因：例如利用珠磨法破碎酵母细胞时，各种酶的释放速度不同，靠近细胞膜和细胞壁的酶先释放，细胞内部或细胞器内后释放。3、问题关键：了解目标产物的性质及其所在位置（1）破坏或破碎存在目标产物的位置。如：存在于膜附近时，可采用温和的方法，如酶溶法，渗透压冲击法和冻结—融化法；存在于细胞质内时，只能采用强烈的机械破碎法。（2）选择性溶解目标产物当目标物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节pH值，离子强度或添加与目标产物具有亲和力的试剂使目标物易于释放，其他杂质不易溶出。同时可采用生化集成4、原则：本章要点珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法和超声波法破碎细胞的基本原理和应用条件？胞内产物的选择性释放的原理？