载体的选择和工程菌的构建过程中应注意的问题

载体的选择和工程菌的构建过程中应注意的问题一、获取目的基因二、重组三、转化反转录法反转录-聚合酶链反应法化学合成法对已发现的基因的改造载体选择重组方法受体细胞的选择转化方法方法四、筛选五、表达筛选方法注意的问题抗性筛选，蓝白班筛选······是否容易产生抗性突变，是否有假阳性融合表达包含体表达分泌型表达表达方式一、获取目的基因目的基因来源用途（决定载体和受体细胞的选择）克隆表达分泌型表达融合表达包含体表达反转录法反转录-聚合酶链反应法化学合成法对已发现的基因的改造目的基因提取方法二、重组质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体M13噬菌体载体噬菌粒载体载体（一）载体的选择载体表达型载体：如pUC18/19，pGEM-T载体克隆型载体：如pBR322，TA载体（二）重组方法：用T4DNA聚合酶将粘性末端连接起来1.克隆基因的酶切位点问题2.载体的酶切问题3.连接片段浓度比的问题需要考虑的问题：(1)黏性末端连接；(2)平末端连接；(3)同聚物接尾连接；(4)接头连接法。三、转化（一）受体细胞的选择大肠杆菌枯草杆菌链霉菌酵母菌昆虫细胞（家蚕）哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）植物细胞（拟南芥菜、烟叶）常用的受体大肠杆菌用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、JM101（Aps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA：LE392、ED8654酵母菌哺乳动物细胞CHO毕赤酵母啤酒酵母重组和转化需要共同注意的问题目的基因的稳定性，酶切位点载体的酶切位点，选择标记载体的拷贝数，载体和受体的相容性受体的表达系统目的菌对密码子的偏爱四、筛选（一）筛选方法（二）注意事项(1)遗传学方法(2)物理筛选法(3)核酸杂交法(4)表达产物分析法1.连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般连接粘性末端酶量的10-100倍。2.在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mgml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mgml。3.连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低效率。4.粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。5.在连接反应中，如不对载体进行去5‘磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。6.麦康凯选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落，当时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。7.X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（b-alactosidase)水解后生成的吲哚衍显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的。8.在含有X-gal和IPTG的筛选上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。五、表达（一）分泌型表达目的蛋白稳定性高目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整（二）包含体表达能简化外源基因表达产物的分离操作能在一定程度上保持表达产物的结构稳定（三）融合表达目的蛋白稳定性高目的蛋白易于分离目的蛋白表达率高目的蛋白溶解性好目的蛋白需要回收小组成员：沈迪、曾宇、屠言贝、张钰英、张寒光、温馨、谢丹、王亮杰、郭正兵、周明毅制作：曾宇