辣椒炭疽病拮抗放线菌F2的鉴定

单位代码10642密级公开学号200906034012学士学位论文（设计）（类型：论文）垫江牡丹主产区土壤重金属含量分析与评价作者：封雪学号：200906034012指导教师：蒋桂芳专业：生物科学（师范）提交日期：2013年5月4日答辩日期：2013年5月16日学位授予单位：重庆文理学院中国重庆2013年5月目录摘要...............................................................ⅠAbstract...........................................................Ⅱ1引言..............................................................12研究区自然状况....................................................13材料与方法........................................................13.1采样的区域及方法.............................................13.2测定项目及方法...............................错误!未定义书签。3.3评价标准与评价方法...........................................13.3.1评价标准...............................错误!未定义书签。3.3.2评价方法...............................错误!未定义书签。4结果与分析........................................................34.1土壤重金属测定结果...........................................34.2土壤重金属评价...............................................55结论..............................................................6参考文献：..........................................................7致谢语..............................................................82013届生物科学专业学士学位论文Ⅰ辣椒炭疽病拮抗放线菌F2的鉴定生物科学1班封雪指导教师蒋桂芳摘要：筛选拮抗活性菌株和寻找新的活性代谢产物，可为辣椒炭疽病防治提供新的资源。此文主要研究永川地区的水果园和蔬菜地采集土壤6份并分离获得放线菌。以辣椒炭疽杆菌为目标菌，采用抑菌带测定法，筛选获得具有拮抗活性的放线菌菌株F2，通过对菌株F2形态观察、培养特征观察、生理生化反应和16SrDNA鉴定，结果表明该菌株为链霉菌属吸水类群（Streptomyceshygroscopicus）。关键词：辣椒炭疽病；拮抗放线菌；形态鉴定；生理生化鉴定周霞：垫江牡丹主产区土壤重金属含量分析与评价ⅡAnalysisandEvaluationofSoilEnvironmentQualityofPeonyinDianjiangCountyofChongqingBiologicalsciencesClassOneZhouXiaTutorLiHuiheAbstract:ObjectiveTostudytheheavymetalsinthechiefsoilsofPeonyinDianjiangCountyofChongqingandprovideabasisfortheGAPbaseestablishment.MethodsAccordingtotheagriculturalsectorstandard（NY5010—2001）ofChina，6pollutantsofsoilwereevaluatedbymeansofsinglepollutionindexandsyntheticpollutionindices.ResultsTheresultoftheresearchindicatedthatthesinglepollutionindexofallsortsofpollutioninthesoilwaslessthan1,showsthatsoilisnotoverweightpollutant.The5.3﹪syntheticpollutionindicesofallsortsofpollutioninthesoilaregreaterthan0.7andsmallerthan1,inthealertlevel,therestofthe94.7﹪comprehensivepollutionindexareallsmallerthan0.7,showsthatsoilqualityisgood,reachingthe“clean”and“safe”levels．ConclusionThesoilenvironmentqualitymeetstherequirementoftheorganicdrugcultureenvironment.Keywords:Dianjiang;Peony;soilenvironmentquality;2013届生物科学专业学士学位论文共8页第1页1引言辣椒炭疽病是半知菌亚门炭疽菌属(ColletotrichumCord)内几个种所引起的真菌病害[1～5]。辣椒炭疽病可为害辣椒叶片和果实[3],在病叶上表现出水浸状褐色圆形斑,病斑上轮生小黑点；病果上为水浸状褐色圆形斑,病斑逐渐凸起,形成灰褐色、黑色或橙红色小粒点,对植株伤害很大，所以给生产造成重大损失。目前对防治炭疽病有的主要方法有依靠化学药剂防治和品种改良。近年来由于人们对环境问题的日益关注和对绿色食品的需求，生物防治成为一个很有发展前途的领域，相关试验表明对炭疽病的防治，生防具有良好的防效。本实验将已分离得到的对辣椒炭疽病具有拮抗作用的放线菌F2，通过对拮抗放线菌F2的形态鉴定和生理生化鉴定，确定菌株的种属，为进一步研究辣椒生物防治提供实验条件。2材料与方法2.1材料2.1.1供试靶标菌拮抗放线菌F2：分离自永川区黄瓜山菜园；病原菌：辣椒炭疽病菌（Colletotrichumgloeosporioides）。2.1.2培养基放线菌培养用培养基：高氏一号琼脂培养基；鉴定用培养基：（1）高氏I号合成培养基（GAU）：可溶性淀粉20g，硝酸钾1.0g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂粉10g，蒸馏水1000mL，调节pH至7.2～7.4。配置时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，边搅拌边加入其它成分，溶化后，补足水分至1000mL。121℃灭菌20min。（2）克氏I号培养基：葡萄糖20g，KNO31.0g，NaCl0.2g，K2HPO41g，MgCO30.3g，CaCO30.5g，FeSO40.1g，琼脂粉10g，蒸馏水1000mL，调节pH7.2～7.4。（3）蔗糖察氏培养基：蔗糖30g，NaNO33.0g，K2HPO41.0g，KCl0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，琼脂粉10g，蒸馏水1000mL，调节pH7.2～7.4。（4）燕麦片培养基：燕麦片20g（水煮30min，过滤取汁），琼脂粉10g，蒸馏水1000mL，调节pH7.2～7.4。（5）葡萄糖天门冬素培养基：葡萄糖10g，天门冬素0.5g，K2HPO40.5g，琼脂周霞：垫江牡丹主产区土壤重金属含量分析与评价共8页第2页粉10g，蒸馏水1000mL，调节pH7.2～7.4。（6）马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：去皮马铃薯200g（切片沸水煮30min，过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂粉10g，蒸馏水1000mL，调节pH7.2～7.4。（7）明胶液化培养基：蛋白胨5.0g，葡萄糖20g，牛肉浸膏3.0g，酵母浸膏1.0g，明胶120g，蒸馏水1000mL，调节pH7.2～7.4，115℃灭菌10min。（8）牛奶凝固胨化培养基：牛奶（脱脂鲜牛奶）1000mL，石蕊液（2.5%）40mL，115℃灭菌10min，间歇灭菌3次。（9）淀粉水解琼脂：可溶性淀粉10g，NaCl0.5g，KNO31.0g，K2HPO40.3g，MgSO4·7H2O0.5g，琼脂粉10g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。（10）纤维素水解培养基：MgSO4·7H2O0.5g，NaCl0.5g，KNO31.0g，K2HPO40.5g，蒸馏水1000mL，调节pH7.2～7.4，滤纸条（0.8×5cm），115℃灭菌10min。（11）H2S产生培养基：蛋白胨10g，胱氨酸0.1g，Na2SO40.5g，蒸馏水1000mL，分装试管后，121℃灭菌20min。（12）碳源利用培养基：（NH4）2SO42.64g，KH2PO40.5g，K2HPO40.5g，MgS04·7H2O0.5g，CuSO4·5H2O0.0064g，FeSO4·7H2O0.0011g，MnC12·4H2O0.0079g，ZnSO4·7H2O0.00l5g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL（选用的碳源分别有1%碳源：L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-果糖、L-鼠李糖、蔗糖、D-甘露醇、L-肌醇）2.2菌株鉴定2.2.1形态学观察将菌株F2划线接种于高氏一号培养基，28°C插片培养7天和14天，显微镜下观察菌体的形态特征。2.2.2培养特征的观察将菌株F2分别接种在PDA、高氏一号琼脂、察氏琼脂培养基、克氏一号培养基、葡萄糖-天门冬素琼脂培养基、燕麦粉琼脂培养基、葡萄糖天冬素琼脂等培养基上，28℃培养5天，观察基内菌丝、气生菌丝的生长状况和孢子链的形态及孢子形状。2.2.3生理生化特性测定测定菌株F2明胶液化、牛奶凝固与胨化、淀粉水解、纤维素的利用、H2S的产生以及碳源利用等生理生化特性[6]。2013届生物科学专业学士学位论文共8页第3页2.2.4分子生物学鉴定进行了16SrDNA的序列分析，其中基因组DNA采用碱裂解法[14]提取质粒DNA，PCR扩增采用16SrRNA通用引物（16SL5-’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；16SR5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’），每50μL体系含37.5μLddH2O、10倍PCR-buffer5.0μL、2.5mmol/LdNTP4.0μL、1μmol/L引物各1.0μL、5U/μLLATaqDNA聚合酶0.5μL和110ng/μL模板DNA1.0μL。PCR反应条件为：94℃5min,预变性；94℃变性0s，60℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。取1%的琼脂糖电泳分析。扩增序列连入PMD-18T载体，由上海英骏生物技术有限公司进行测序。测得的16SrDNA序列与GenBank数据库中序列进行BLAST分析，并利用BioEdit和MEGA3.1软件构建系统进化树。式中：P综—为土壤中综合污染指数；Pmax—为单项污染指数最大值；Pave—为单项污染指数平均值。综合污染指数法评价结果的分级标准见表2。表2土壤环境质量分级标准等级划分综合污染指数污染指数污染水平1P≤0.7安全清洁20.7P≤1.0警戒级尚清洁31.0P≤2.0轻污级超过背景值视轻污染42.0P≤3.0中污染作物受到中度污染53.0P重污染污染已相当严重4结果与分析4.1土壤重金属测定结果各个样点的土壤中的铜、镉、铬、铅、砷、汞单项指标元素均有不同程度的检出。周霞：垫江牡丹