酵母和大肠杆菌细胞的破碎及破碎率的测定

一、酵母和大肠杆菌细胞的破碎及破碎率的测定一、实验原理1.超声波破碎细胞的实验原理频率超过15～20kHz的超声波，在较高输入功率下（100～250W），通过超声波发生器和换能器的作用,将电能转换为声能，震动波通过浸入在样品中的钛合金变速杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而起到破碎细胞等物质的作用。2.采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质溶液在270～280nm具有一个紫外吸收高峰。在一定范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯比尔定律。由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量及所处的微环境不同，故蛋白质溶液在280nm的吸光度值不同。3.血球计算板使用原理计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格，而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格，而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。a.16格×25格的血球计数板计算公式:细胞数/ml=100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数b.25格×16格的血球计数板计算公式:细胞数/ml=80小格内细胞个数/80×400×10000×稀释倍数二、实验流程图1.啤酒酵母的破碎啤酒酵母培养（菌种纯化、扩大培养）→破碎前计数（采用紫外分光光度计测OD280定性检测蛋白）→细胞超声破碎（80ml酵母细胞悬浮液置于100ml容器中，浸没超声发射针1cm；频率中档超声4s，间歇6s，80-120次；0.5ml悬液稀释1000倍，电子显微镜观察、计数；另取1.5ml酵母破碎液12000r/min4℃离心10min取上清，紫外分光光度计测OD280定性检测蛋白的释放情况；留取50ul上清加入2×SDS上清缓冲液，煮沸5min，-20℃保存，待下次实验用。2.大肠杆菌细胞的破碎啤酒酵母培养（菌种纯化、扩大培养）→破碎前计数定性检测蛋白→细胞超声破碎（80ml酵母细胞悬浮液置于100ml容器，浸没超声发射针1cm；频率中档超声4s，间歇5s，80次；取1.5ml细胞悬浮液12000r/min4℃离心2min取上清，紫外分光光度计测OD280定性检测蛋白的释放情况；留取50ul上清加入2×SDS上清缓冲液，煮沸5min，-20℃保存，待下次实验用。三、实验结果酵母06080100120140160细胞剩余个数（m）mOD280蛋白浓度大肠杆菌06080100120140160mOD280蛋白浓度四、实验分析