酵母静止的细胞中的肌动蛋白体是一个可立即使用的肌动蛋白储备

酵母静止的细胞中的肌动蛋白体:一个可立即使用的肌动蛋白储备?大多数真核细胞在其生命的大多数时间处于一个静止的状态,准备特定的增殖信号。在酿酒酵母中,进入和退出静止状态仅仅取决于环境中的可利用的营养物质。从静止到增殖的转变不仅需要剧烈的代谢变化，还需要一个完整的多种细胞结构的重建。在这里,我们描述了一个酵母静止状态特异的肌动蛋白细胞骨架组织。当细胞停止分裂,肌动蛋白重组为一个我们称为“肌动蛋白体”的结构。我们的研究表明肌动蛋白体包括F-肌动蛋白和一些肌动蛋白结合蛋白，如丝束蛋白和成帽蛋白质。此外,通过与肌动蛋白斑或肌动蛋白线的对比,我们发现肌动蛋白体大多是固定的,并且我们没有发现任何肌动蛋白丝的转换。最后,我们的研究表明,在细胞的再培养中肌动蛋白体迅速消失,而且在蛋白质从头合成缺乏的情况下肌动蛋白线和斑可以被装配成肌动蛋白体。这使我们提出,肌动蛋白体是一个肌动蛋白的储备,它可以在再次进入一个增殖周期时为肌动蛋白线和斑的形成而迅速动员。介绍细胞生长和增殖的控制是生命的一个关键特性。大多数原核和真核细胞其最大部分的寿命是处于一个称为静止的非增殖状态。令人惊讶的是,一个关于多种细胞过程控制细胞增殖周期的巨大的信息体是可以利用的,而生物学上的静止周期却鲜为人知。静止周期是细胞退出增殖周期的一个过程；进入并且维持一个稳定的,非增殖状态;最后,在特殊的环境条件下,又返回到细胞分裂周期。破解从增殖到静止的转换机制是一个巨大而紧急的研究领域。在多细胞生物体,细胞增殖主要依赖于生长因子和激素,也可能依赖于涉及整个生物环境的参数。因此研究这些生物中的静止周期是非常具有挑战性的。相比之下,单细胞微生物如酿酒酵母的增殖“完全”取决于环境中营养物质的可用性,因此更适合研究涉及进入和退出静止周期的过程。在营养枯竭时,增殖的酵母细胞完成细胞周期,停止成长,并且进入静止状态作为不萌发的细胞。静止状态的正确建立显然涉及由一组复杂的级联信号,如TOR和RAS途径控制的活跃的过程。此外,酵母细胞进入静止将彻底地修改他们的新陈代谢。他们积累碳水化合物、聚磷酸盐,并且大大降低蛋白质的合成率。最近,DNA微阵列分析表明,尽管在进入静止后大多数基因下调,然而一些特定基因的转录被诱导,此外,一些特殊的转录物在静止细胞中富集。因而,这些研究揭示了发生在进入静止状态时特定的表达谱的“重新编程”。在细胞水平上,酵母细胞进入静止状态后产生出一个厚厚的细胞壁,它赋予了细胞一个对温度、渗透压或化学压力更高的耐受性。此外,静止的酵母细胞显示为凝聚的染色体和点状的线粒体网络;然而,在进入静止状态时其其他细胞结构潜在的重塑则很少为人所知。在肌动蛋白细胞骨架是最动态细胞装置之一,而且对于各种不同的细胞过程如细胞形态、迁移、极化、收缩、分裂或细胞内运输等都是至关重要的。对于协调微丝(肌动蛋白)快速组装和去组装及调节参与各种结构如应力纤维或收缩环的形成等巨大数量的信号通路,肌动蛋白网络是高度响应的。活跃的增殖酵母细胞显示三个包含F-肌动蛋白的结构:肌动蛋白丝,作为运输小泡,细胞器和信使rna的极向运输的道路;内吞作用所需的肌动蛋白斑;肌动蛋白-肌球蛋白细胞动力环。一整套的保守的肌动蛋白结合蛋白(ABPs)紧密协调这些高度动态的包含f-肌动蛋白的结构的形成和维持。尽管许多研究描述了复杂的分子间相互作用的网络,这些相互作用在分裂活跃的酵母细胞中调节肌动蛋白细胞骨架,但是很少有人了解它在静止细胞中的组织作用。在这里,我们仔细地描绘了出芽酵母在进入和退出静止状态时肌动蛋白细胞骨架的重建。我们描述了一个静止细胞特异的肌动蛋白细胞骨架组织,我们将其命名为“肌动蛋白体”。我们进一步解释了这一新结构的构成、定位和动态性。最后,我们证明了当补充营养使细胞退出静止状态时肌动蛋白体的命运。根据我们的数据,我们提出肌动蛋白体作为肌动蛋白储备,可以立即用于细胞进入下一个增殖周期。材料和方法菌株,培养基,和质粒菌株。除了特定的外,在这项研究中所采用的所有的酿酒酵母菌株都是对BY4742或BY4741(以s288c为背景)等基因系的，来自于Euroscarf(Frankfurt,德国)并且如表1所列。携带绿色荧光蛋白(GFP)融合物的酵母菌株来自于英杰公司(Carlsbad,CA)。培养基。YPDA培养基如前所述。SDcasa培养基中补充1.8mM尿嘧啶、0.2mM色氨酸和0.3mM腺嘌呤。包含2%乳酸的培养基在Chateaubodeau等(1976)中有描述,而含N3甘油的培养基在Lefebvre-Legendre等(2001)中有描述，在此基础上补充2%的乙醇。为了测试在营养匮乏时的可行性,我们使用一个含有0.1%的葡萄糖和赤藓红的SDcasaWAV培养基，如Bonneu等(1991)中所述。为了按时间顺序的老化试验，细胞在30℃下在液体YPDA培养基中生长7d，然后将其连续稀释物种植在重复的YPDA培养基上。培养基的百分比是经过100%的生存的野生型菌株标准化的,并且是两个独立实验的平均值。质粒。P2893是在ABP140编码序列位点的3’末端集成了三个串联的GFP拷贝。P2932是在CAP2编码序列位点3’末端集成了三个串联的GFP拷贝。这个CAP2-3xGFP融合蛋白是有功能的,即,不是与sac6Δ合成致死的。P2934是在SAC6编码序列位点3’末端集成了三个串联的GFP拷贝。SAC6-3xGFP融合蛋白是有功能的(即，不是与abp1Δ合成致病的)。P3006是在ABP1编码序列位点3’末端集成了三个串联的GFP拷贝。ABP1-3xGFP融合蛋白是有功能的(即,不是与sac6Δ合成致病的)。详细的结构和基因序列可按要求提供。显微镜落射荧光显微镜。应用一个完全自动化的蔡司200M倒置显微镜来观察细胞,该显微镜配有一个ms-2000载物台,一个LambdaLS175W氙气光源,一个100*1.4数值孔径的高度消色物镜和五个位置的过滤塔。过滤数据集如下:对于Alexa-phalloidin568:Cy3(例:HQ535/50-Em:HQ610/75-BS:Q565lp),对于活细胞GFP:具有GFP长通性(例:HQ470/40-Em:HQ500lp-BS:Q495lp),而对于固定细胞GFP共区域化HQ异硫氰酸荧光素窄带(例:HQ487/25-Em:HQ535/40-BS:Q505lp)。图像使用CoolSnapHQ相机拍摄。显微镜、相机和快门用SlideBook软件处理。光漂白(FRAP)后的荧光恢复都使用了附加到显微镜的照明器部分的微点波长可调节激光系统。该系统使用了一个由光纤电缆耦合到显微镜的氮气脉冲激光器。非相干光使用香豆素蓝化学室进行同步化和放大,在440nm波长下发出。同时的光漂白和荧光照明是通过使用一个分光镜(50%白光/50%激光)由荧光灯和激光束直接照射到显微镜的荧光器实现的。激光的XY定位是由两个计算机驱动的以电流计为基础的转向镜头控制的。一个12像素区域的荧光强度是在z-stacks最大投射的情况下测量的。荧光强度In按如下公式计算:In=(I感兴趣的区域-I背景)/(I对照区域-I背景)。荧光比率为I0/In。可参考Luedeke等(2005)。为了绿色荧光蛋白成像，酵母细胞种植在30°C下的有适当补充SDcasa培养基中。为了延时生长细胞的显微,取2-2.5μl的培养物于玻片上，并立即在室温(22℃)成像。使用Alexa-phalloidin568(表达载体)的鬼笔环肽染色如先前描述。所有的照片(除了指定的以外)都是通过0.3μM的Z步骤在Z-stacks的最大投射下获得的。电子显微镜。酵母细胞在30℃下于50毫升YPDA培养基中220rpm摇床培养3d。细胞球被放置在电子显微镜铜网格(400网)的表面，其上已涂有聚醋酸甲基乙烯脂。每个循环非常迅速地浸没在预冷的液体丙烷中，并且储存于-180℃液氮中。然后循环被转移到预冷的0.1%戊二醛干燥的丙酮溶液中，在-82℃保存3d。样品在-20℃用丙酮漂洗并逐步嵌入在LRGold树脂中。树脂聚合物在-20℃经紫外光照射7d。超薄LRGold部分聚有涂镍的网格线。该部分首先在1mg/ml甘氨酸中温育5分钟，然后在胎牛血清(1:20)中温育5分钟。网格在室温下用稀释1/200的鼠抗肌动蛋白单克隆抗体温育45分钟,然后用Tris-缓冲液生理盐水漂洗:0.1%牛血清白蛋白，并且在室温下用连接于10nm金颗粒的抗小鼠免疫球蛋白IgG温育45分钟。这个部分是用蒸馏水漂洗,与2%醋酸双氧铀水溶液漂洗5分钟形成对比,紧接着用1%柠檬酸铅漂洗1分钟。标本用飞利浦Tecnai12Biotwin(120千伏)电子显微镜观察。免疫印迹总蛋白提取物使用三氯乙酸及Reid和Schatz(1982)中描述的玻璃珠方法预处理。抗体是B·Goode送的。鸡的抗酵母肌动蛋白抗体使用1/5000的;鸡的抗酵母Abp1p抗体使用1/5000的;鸡的抗酵母Cap1/2p抗体使用1/2500的;鸡的抗酵母丝束蛋白(Sac6p)抗体使用1/5000的;鼠的抗Scp1p抗体使用1/1000的。连接有HRP的抗鸡和抗鼠的二级抗体使用1/10000的。杂项葡萄糖浓度是使用葡萄糖/果糖紫外线测试组件测定的。Latrunculin-A是B·Goode送的,且使用浓度为200μm。放线菌酮使用的最终浓度是100μg/ml。结果静止的酵母细胞的肌动蛋白细胞骨架在身体内是有秩序的在这项研究中,我们选择遵循现行的Gray等(2004)提出的静止细胞的定义。并且以前用于转录组研究,也就是说,静止细胞是在30℃固定培养于富含葡萄糖的液体培养基中获得的。我们在培养于富含葡萄糖的培养基的野生型酵母细胞生长的不同阶段，模拟了酵母肌动蛋白细胞骨架的重组。如前面广泛描述的一样,活跃增殖的酵母细胞显示的肌动蛋白细胞骨架由三个含有F-肌动蛋白结构组成:肌动蛋白丝、肌动蛋图1.在进入静止状态时的肌动蛋白细胞骨架重组。(A)野生型酵母细胞生长在30℃下YPDA中。细胞密度使用OD600nm进行测量(灰色线)。在不同的生长阶段,取样,测定培养基中葡萄糖浓度(灰色三角形),细胞用Alexa-phalloidin染色。对于每个时间点,具有极化肌动蛋白细胞骨架的细胞(黑色虚线),具有去极化的肌动蛋白细胞骨架的细胞(空心方框),或具有肌动蛋白体的细胞(黑色曲线)都被计数(对于每个时间点n﹥200)。萌芽指数(出芽细胞的比例)用黑色的圆圈显示(对于每个时间点n﹥200)。(B)左侧的图片,在对数生长期(在A中时间点为3h时)极化细胞的例子。中间的图片,在两个阶段相互转变时(在A中时间点为6.5h时)去极化细胞的例子。右侧的图片,具有肌动蛋白体处于静止状态(在A中时间点为72h时)的细胞的例子。图像是二维的(2d)三维(3d)图像叠加物的最大投影。比例尺,2μm。(C)细胞进入静止状态时Abp1p,Act1p和Cap1/2p稳态水平的免疫印迹分析。时间点和与A中时间点对应的OD值。白斑和肌动蛋白细胞动力环。肌动蛋白丝和肌动蛋白斑的活动增长位点是被极化的(处于胞质分裂的芽顶和芽颈;图1B，左)。在两阶段生长的转变中,对应于葡萄糖匮乏,肌动蛋白丝变得紊乱和肌动蛋白斑在细胞内去极化。然后,肌动蛋白丝消失了,结构重建的肌动蛋白斑仍然是去极化的(图1B，中)。最后,肌动蛋白斑消失了,然而一个我们称为肌动蛋白体的新的肌动蛋白组织出现了(图1B,右)。几小时内,我们在大多数的细胞群中发现肌动蛋白体(图1A,黑色的曲线)。因为他们可以被鬼笔环肽染色,所以肌动蛋白体包含真实的F-肌动蛋白。肌动蛋白体没有一个特定的形状,他们可以是球形的或拉长的。当处于细长状态时,肌动蛋白体显示为多变的厚度和曲率。此外,每个细胞可以拥有一个或多个肌动蛋白体。典型的例子如图1B(右)所示。在整个稳定时期肌动蛋白细胞骨架仍然组织于肌动蛋白体内,而且我们能够在只生长2个月的细胞中观察到肌动蛋白体(未发表过的数据)。基于这些观察,很明显在静止细胞中仍然存在巨大数量的F-肌动蛋白。稳