酶与蛋白质工程第2章酶与酶工程.

第二讲酶与酶工程酶的概念酶是一类由活细胞产生的对其特异底物具有高效催化作用的特殊蛋白质或核酸简单地说，酶是一类由活细胞产生的生物催化剂酶作为生物催化剂的特点高效性专一性反应条件温和酶的催化活性可调节控制TheNobelPrizeinChemistry1907forhisbiochemicalresearchesandhisdiscoveryofcell-freefermentationb.1860d.1917LandwirtschaftlicheHochschule(AgriculturalCollege)Berlin,GermanyGermanyEduardBuchnerTheNobelPrizeinChemistry1946fortheirpreparationofenzymesandvirusproteinsinapureform“forhisdiscoverythatenzymescanbecrystallized1904-19711891-19871887-1955RockefellerInstituteforMedicalResearchPrinceton,NJ,USARockefellerInstituteforMedicalResearchPrinceton,NJ,USACornellUniversityIthaca,NY,USA1/4oftheprize1/4oftheprize1/2oftheprizeWendellMeredithStanleyJohnHowardNorthropJamesBatchellerSumner(一)根据酶的化学组成分类：1、单纯酶：只含有蛋白质成分，如：脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等2、结合酶：含有蛋白成分(酶蛋白)和非蛋白成分(辅助因子)酶的分类*两部分在催化反应中的作用酶蛋白决定反应的特异性辅助因子决定反应的种类与性质蛋白质部分：酶蛋白辅助因子金属离子小分子有机化合物全酶维生素铁卟啉(二)根据酶蛋白结构特点分类单体酶：由一条肽链组成的酶分子寡聚酶：由两条或多条肽链组成的酶分子。为大多数酶多酶复合体：由多种酶彼此聚合形成的复合体,催化连续的一系列相关反应。丙酮酸脱氢酶复合体多功能酶：一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，往往是基因融合的产物。高等动物的脂肪酸合酶由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类酶称为多功能酶由单肽链构成的，含有若干个酶活性结构域活性中心：酶分子中结合底物并起催化作用的少数氨基酸残基形成的一定空间结构。包括底物结合部位和催化部位酶的活性中心酶活性中心结合部位：与底物结合，使底物与酶的一定构象形成复合物，决定酶的专一性催化部位：影响底物中某些化学键的稳定性，催化底物转变成产物的部位，决定酶的催化效率和催化反应的性质酶活性中心的特点a.酶的活性中心位于酶分子表面的”空穴“中，为非极性环境b.酶的活性中心只有几个氨基酸组成，多为极性氨基酸c.活性中心的几个氨基酸残基在一级结构上可能相距很远，甚至位于不同肽链上，通过肽链的盘绕折叠而在空间结构上相互靠近，形成一个能与底物结合并催化底物形成产物的位于酶蛋白分子表面的特化的空间区域d.酶的活性中心具有柔性，可与底物诱导契合发生相互作用e.酶的活性中心与底物的结合通过次级键酶活性中心的特点必需基团：在酶分子中有一些基团对维持酶活性中心应有的空间构象及发挥正常的催化活性是必需的，若将这些基团改变后会导致酶的催化活性减弱甚至丧失活性中心内外都可以有必需基团酶必需基团非必需基团活性中心活性中心外基团结合基团催化基团酶的专一性机制诱导契合学说该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状E+SP+EES能量水平反应过程GE1E2酶（E）与底物（S）结合生成不稳定的中间物（ES），再分解成产物（P）并释放出酶，使反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快反应速度E+SE-SP+E中间产物学说酶的高效性机制邻近效应和定向效应在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点邻近定向效应酶促反应动力学酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响酶反应速度的各种因素的科学影响酶反应速度的因素有：底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂、抑制剂等在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，为一级反应底物浓度增大与速度的增加不成正比,为混合级反应当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值Vmax，此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应底物浓度对酶促反应速度的影响V-S曲线底物浓度对酶促反应初速度的影响V初Vmax低1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反应的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程V=Vmax[S]Km+[S]米氏方程酶浓度对酶反应速度的影响在有足够底物和其他条件不变的情况下，反应速度与酶浓度成正比即：当[S][E]时，V=Km×[E]0酶浓度反应速度温度对酶反应速度的影响一方面是温度升高,酶促反应速度加快另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失因此大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下,反应速度最大最适温度不是一个固定的常数pH对酶反应速度的影响酶反应的最适pH(optimumpH)反应速度pH最适pH68100酶的最适pH也不是一个固定的常数，它受到底物的种类、浓度；缓冲液的种类、浓度;酶的纯度;反应的温度、时间等的影响激活剂对酶反应速度的影响1.无机离子(1)一些金属离子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等(2)阴离子：如Cl-、Br-、I-、CN-等凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂,激活剂对酶的作用具有一定的选择性2.有机分子还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽金属螯合剂：EDTA抑制剂对酶活性的影响能够引起酶的活性降低或丧失的化合物称为抑制剂。具有不同程度的选择性抑制作用类型：(一)不可逆抑制作用：抑制剂与酶反应中心的活性基团共价结合，引起酶的永久失活(二)可逆抑制作用抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性常见的不可逆抑制剂1）有机磷化合物、有机汞、有机砷化合物(抑制-SH巯基酶)、氰化物、烷化剂(碘乙酸、碘乙酰胺)等。2）二异丙基氟磷酸(DIPF)对含Ser-OH的酶的不可逆抑制。均为剧毒物质+(CH3)3N+CH2CH2OCOCH3(CH3)3N+CH2CH2OH+CH3COOHH2O胆碱乙酰化酶胆碱酯酶胆碱乙酰胆碱有机磷杀虫剂能抑制胆碱酯酶活性，导致乙酰胆碱的堆积，造成神经过度兴奋直至抽搐而死乙酰胆碱----传递神经冲动有机磷农药（敌百虫、沙林）胆碱酯酶OHPOC2H5OC2H5S有机磷农药神经传导中毒！！！抑制剂二异丙基氟磷酸酯引起酶的永久失活竟争性抑制某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制可逆抑制作用分为三类：非竟争性抑制酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导致酶活性下降。抑制剂与活性中心以外的基团结合，不与底物竞争酶的活性中心反竞争性抑制作用ESIESP+EE+S+I酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下降P+E×酶的活性调节酶的活性调节包括两个方面：调节酶浓度：酶的诱导与阻遏、酶的选择性降解调节酶活性：变构调节、可逆共价修饰、酶原激活变构调节当酶分子与某些化合物非共价结合后发生构象改变，从而引起酶活性的变化，这种调节称别构调节。受别构调节的酶称变构酶(或别构酶)，引起酶的活性受到别构调节的化合物称效应物(或变构剂)正效应物—变构激活负效应物—变构抑制共价调节酶常见的是磷酸化/脱磷酸化，腺苷酰化/脱腺苷酰化，乙酰化/脱乙酰化，尿苷酰化/脱尿苷酰化，甲基化/脱甲基化，S-S/SH相互转变酶分子被其他酶催化进行可逆的共价修饰，引起酶活性的改变共价调节酶最典型的例子是动物组织的糖原磷酸化酶磷酸化酶磷酸酶磷酸化酶激酶磷酸化酶a（有活性）磷酸化酶b（无活性）磷酸化酶a和磷酸化酶b的转变过程+酶原及酶原的激活1.酶原(zymogen)：酶的无活性的前体2.酶原的激活：从无活性的酶原转变为有活性的酶的过程3.酶原激活的本质：是酶活性部位形成或暴露的过程酶原存在的意义消化道内蛋白酶以酶原形式分泌，避免细胞产生的蛋白酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定部位和环境中发挥作用；此外，酶原可视为酶的储存形式，如凝血和纤维蛋白溶解酶类以酶原的形式在血液循环中运行，一旦需要便转化为有活性的酶胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽肠激酶活性中心胰蛋白酶原的激活示意图胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽肠激酶胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶原弹性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶尽管人类19世纪前后才建立起酶的概念，但酶的催化作用却很早就为人们的生活所利用比如：(1)在人类游牧生活时期，就已会利用动物胃液来凝固牛乳(2)人类在4000多年前就已掌握的酿酒和制酱技术其实也是酶作用的结果最初的商品酶制剂主要以动植物为原料提取，如从牛胃中提取凝乳酶、从胰脏中提取胰酶、从血液中提取凝血酶、从植物材料中提取淀粉酶等之后，Takamine利用霉菌来生产淀粉酶使得酶制剂工业取得突破，其方法至今仍被采用第二次世界大战以后，随着微生物培养技术、发酵工业和设备的渐渐完善，利用微生物获得商品化酶制剂已形成规模化产业，并开辟了广阔的市场20世纪90年代，随着基因工程的广泛介入，一些原来只能由动物或植物生产的酶，经过酶基因重组，可以在微生物上表达由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制，因此“基因工程＋发酵工艺＋先进的发酵设备”可以算是酶工业的第三次飞跃酶工程酶工程：酶制剂在工业上的大规模生产和应用酶工程研究简史•1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备得到淀粉酶，开创了酶技术走向商业化的先例•1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，用于皮革的软化及洗涤•1908年，法国的Boidin制备得到细菌淀粉酶，用于纺织品的褪浆•1911年，Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清•1949年，用微生物液体深层培养法进行－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕•1960年，法国科学家Jacob和Monod提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量在酶的应用过程中，人们注意到酶的一些不足之处，如：稳定性差，对强酸碱敏感，只能使用一次，分离纯化困难等解决的方法之一是固定化1971年第一届国际酶工程学术会议在美国召开,当时的主题即是固定化酶，进一步开展了对微生物细胞固定化的研究1973年,千烟一郎首次利用固定化的大肠杆菌细胞生产L-天冬氨酸1978年,日本的铃木等固定化细胞生产α-淀粉酶研究成功，所以70年代是固定化细胞技术取得进展的时期80年代，固定化细胞已能用于生产胞外酶，又发展了固定化原生质体技术，排除了细胞壁这一障碍在酶的固定化技术发展的同时，酶分子修饰技术也取得了进展60年代，用小分子化合物修饰酶分子侧链基团，使酶性质发生改变70年代，修饰剂的选用、修饰方法上又有了新的发展此外，对抗体酶、人工酶、模拟酶等方面，以及酶的应用技术研究，在近20年均取得了较大进展，使酶工程不断向广度和深度发展，显示出广阔而诱人的前景化学酶工程由酶学与化学工程技术相结合而形成通过化学修饰、固定