酶切连接经验之谈

酶切本实验室条件下酶切连接经验之谈1、PCR产物可以切胶回收后酶切，用Elutionbuffer溶解即可，不影响后续实验。2、50ulPCR产物切胶回收后用35ulElutionbuffer溶解后只需取一半体积用于后续实验即可满足要求。3、PCR产物可以用乙醇沉淀法获得DNA用于后续反应，但需取少于一半的量用于后续实验，否则会不能完全切开而导致实验失败。4、双酶切时，若2种酶不是同一厂家时，可以根据Thermo厂家该2种酶的共同buffer，选用Tango缓冲液，一般50ul体系各加1ul酶，而快切酶只需0.5ul,切3小时即可。5、添加酶切试剂时，应先将buffer和样品振荡均匀后再加入相应的酶，轻弹混匀即可。6、观察酶切后的载体片段会比质粒大很多，PCR产物双酶切后的片段也比未酶切时要大，并且酶切后产物有时会呈现稍微弥散的宽带，由此可以判断是否切开。7、部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI,BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：（1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；（2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coliJM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。8：E.coliJM110要排除dam,dcm甲基化的影响，需要用特定的dam-,dcm-的菌株，如JM110如果由JM110或SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒，则不会被甲基化.若酶切不成功可以考虑以下因素的影响a)有些内切酶对PCR产物酶切效率较低b)双酶切无共同buffer时，可以采用分步酶切c)PCR产物直接双酶切不成功，可以选择先做TA克隆后再双酶切d)当载体的2个酶切位点很接近，或者其中一个酶切效率很差时，可以对载体进行去磷酸化，该酶为牛小肠碱性磷酸酶，在大多数限制酶缓冲液中均有活性e)导致“星星活性”可能是体系中甘油浓度过高、高PH、较低的离子强度所致。连接1、一定要选择未经过反复冻融的连接buffer，并准确加入，确保其终浓度准确。2、目的片段和载体比例不是影响连接成功与否的关键原因，依据经验，取相等质量的的目的片段和载体即可，载体可以尽量少加一点。3ug载体（5kb）相当于2pmol线性DNA或者4pmol双酶切产物。3、多个片段连接时，体系中，终浓度的各个片段与载体相同即可。4、高质量的连接反应无需灭活，可直接用于转化。5、连接90min即可满足实验要求。提高连接效率可以参考以下操作a)如需连接的片段和载体冻存多时，可以先55℃变性10min后立即冰上退火，再在冰上操作，加入其它组分等b)对于连接效率较低的情况下，可以用PCR仪在16℃和4℃之间循环。