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酶动力参数Km、Vmax和Kcat值的计算（以日立U3010为例）强玮2014-3-31一、Km根据酶促反应方程，即米-曼式氏方程（Michaelis-Mentenequation）：V=(VmaxS)/(Km+S)当v=0.5Vmax时，Km=[S]，可见Km等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半时的底物浓度。Km值一般在10-6~10-2mol/L之间，单位一般为mM或者uM。Km只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。由于Km值与酶的浓度无关，所以计算时无需对蛋白进行定量，理论上诱导破碎的菌体上清（粗酶液）即可用来测酶活计算。具体计算方法以前常用双倒数法，但是这种算法现在稍微好一点的SCI杂志都不认可了，相对来说现在更准确和更常用的计算方法是直接对不同浓度的底物测得的酶活数据用米氏方程（Michaelis-MentenequationV=(VmaxS)/(Km+S)）进行非线性回归（nonlinearregression），拟合的方程中就给出了计算出的Km值。非线性回归方法相对于双倒数法稍微麻烦的地方在于测量酶活时底物浓度的选择要尽量多，并且要覆盖米氏方程曲线的三个区域，以下图为例，酶反应速度遵循米氏方程的规律，先是一级反应，速度随底物浓度上升也直线上升，然后是混合级反应，趋于平缓，最后进入零级反应，反应速度不再随浓度上升而上升，而是趋于一个稳定的值。根据这个规律，具体梯度测试时，底物浓度的选点很重要，要根据实时测得的斜率或活度值实时调整，尽量要覆盖这三个区域，这样回归拟合出来的米氏方程才是准确的，计算出的酶动力参数才是正确的。020400.00.10.20.3初速度底物浓度(mM)初速度HillFitof初速度用于非线性回归分析的软件很多，Origin8.0我比较喜欢，将酶活数据输入后，全选，“Analysis”菜单下选择“Fitting”，进一步选择“Nonlinearcurvefit”进入对话框，在函数归类框“Category”中选址“Growth/Sigmoidal”类函数，接着在子函数框“Function”中选择“Hill”函数。由于Origin8.0中没有保存米氏函数，但是Hill函数与米氏函数类似(如下)（“OriginBasicFunctions”函数下的Hyperbl也是类似与米氏函数的可选函数），当n=1是就完全变成了米氏函数，所以接着在左边的“Parameters”中将n=1的可选框构上，点击“Fit”进行拟合，Km、Vmax值等拟合的数据就在弹出的窗口中显示出来了，注意这里的Vmax值不是本文所指的Vmax值，两者的意义和单位都不一样，发表用的Vmax单位通常为nkat×mg-1protein（见下文），而此处的Vmax为输入数据时的Y轴值，如果数据由日立U3010分光光度计测得，则其代表“活度”，即每分钟内吸光度变化的量。XnHill函数：Y=VmaxKn+Xn二、VmaxVmax表示在一定酶量下的最大反应速率，即酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度呈正比。通常发表论文的Vmax单位为nkat×mg-1protein，表示每毫克纯化的蛋白有多少个nkat活力。这里有必要弄清楚酶活力单位的意义，国际上有两种活力单位：IU和Kat，它们的意义分别为：1IU：指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。1Kat：在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。Kat和IU的换算关系：1Kat=6×107IU，1IU=16.67nKat日立U3010测得的酶活力是用“活度”表示的，即每分钟内吸光度变化的量。所以要将活度换算为Kat，首先必须将吸光度的变化与底物的变化联系起来。这里的底物是指具有特定波长的光吸收，用来指示酶反应进程的物种，如氧化还原酶通常选择NADH/NADPH。这里以托品酮还原酶TRI为例，测定340nm处NADPH的活度值。首先吸光度Abs与底物浓度c是有公式联系的：Abs=c·ε·l在实际测定中，“ε·l”部分可以作为一个常数处理，在一个反应体系中将NADPH的浓度固定，测出吸光度A值后即可换算出“ε·l”值，通常选3个浓度，取三个“ε·l”的品均值。如TRI的酶活测定中：200uM·ε·l=1.342→ε·l=0.00671100uM·ε·l=0.721→ε·l=0.00721平均ε·l=0.00696由于活度的意义是1min内吸光度的变化量，则选取一个线性比较好的酶反应的动态吸光度曲线，记录下它0s和60s两个点的吸光度值，用上面得到的ε·l值算出各自的底物浓度，其差值对应的就是该活度下的底物变化量。如一反应:活度=0.1182/min0sAbs=1.221→c(NADPH)=175.4uM60sAbs=1.103→c(NADPH)=158.5uM由于反应体系是1ml,则变化量为△c(NADPH)=175.4-158.5=17nM，所以活度0.1182/min对应17nM的NADPH变化量，即每分钟，0.1182个活度表示有17nM的NADPH发生了转化。为便于计算，换算为：0.1活度/min=14.38nM/min(NADPH)这样，吸光度的变化与底物的变化联系起来就联系起来了，用酶活力单位IU的定义来换算，很容易就得出：0.1活度/min=0.01438IU=0.24nKat将上面非线性回归得到的Vmax（活度）值按上面的公式换算就得到了nKat值，进一步除以每管反应蛋白的量（mg）,就得出了标准Vmax（nkat×mg-1protein）的值。以木本曼陀罗TRI3号重组蛋白为例，其对托品酮酶活拟合的结果是Km=2.65mM,Vmax=0.48879/min(活度)，每管反应酶量为13.285ug,则其Vmax=4.8879×0.24/0.013285=88.3nkat×mg-1protein三、KcatKcat是酶的催化常数，定义为在单位时间内每一活性中心或每分子酶所能转换的底物分子数，表示酶催化特定底物的能力。其单位一般是s-1，即每秒钟内一个酶分子或酶活性中心能催化多少个底物发生反应。还是以托品酮还原酶TRI催化托品酮和NADPH的为例，其反应方程式如下：托品酮+NADPH→托品+NADP物的转化量度关系上式0.1活度/min=14.38nM/min(NADPH)已经提供了，我们只需对反应中的蛋白定量就行了。还是以上面的例子计算，非线性回归拟合出的Vmax=0.48879/min(活度)，对应的底物（NADPH）转化量是△c(NADPH)=4.8879×14.38=70.29nM/min。每管反应酶量为13.285ug,重组酶蛋白的分子质量为33245.88道尔顿（这里的重组酶分子质量一定要加上前面融合的标签序列，这里是His标签），则酶分子数为13285/33245.88=0.40nM,每秒钟每个酶分子催化的底物分子数即Kcat=70.29/(0.40×60)=2.93s-1。注意：上面的计算默认了每个酶分子都作为一个活性中心参与了催化反应，而没有顾及其是否以二聚体或多聚体的形式。事实上，有些酶是只以多聚体形式才有活性的，这时就要准确弄清楚是几聚体，然后将相应的Kcat值除以该值才是准确的。四、Kcat/KmKcat/Km用来衡量酶的催化效率。这一表示式又被称为特异性常数，其包含了催化反应中所有步骤的反应常数。由于特异性常数同时反映了酶对底物的亲和力和催化能力，因此可以用于比较不同酶对于特定底物的催化效率或同一种酶对于不同底物的催化效率。其算法很简单，用Kcat值除以Km值即可，单位一般为s-1×M-1或s-1×mM-1，注意两者是1000倍的关系，如上例，其Kcat/Km=2.93/3.65=1.11s-1×mM-1=1110s-1×M-1。