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酶工程期末复习第一章绪论1.影响酶活因素的问题：受到底物浓度、产物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。（1）底物浓度的影响：米氏方程、反应速度与底物浓度的关系呈现L型曲线。（2）产物浓度的影响：正反馈调节作用（如6-磷酸葡萄糖对糖原合成酶）和负反馈调节作用（如6-磷酸葡萄糖对己糖激酶），后者更普遍。（3）酶浓度：底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。（4）温度：反应速度与温度呈抛物线型关系，存在最适温度，添加酶的作用底物或者某些稳定剂可以适当提高酶的热稳定性。（5）pH：每种酶都有各自的适宜的pH范围和最适pH，因为在不同的pH条件下，酶分子和底物分子中基团的解离状态发生改变，从而影响酶分子的构象以及酶与底物的结合能力和催化能力。（6）抑制剂：能够使酶的催化活性降低或者丧失的物质称为酶的抑制剂。抑制剂有可逆性抑制剂和不可逆抑制剂之分。不可逆性抑制剂与酶分子结合后，抑制剂难于除去，酶活性不能恢复。可逆性抑制剂与酶的结合可逆，只要将抑制剂除去，酶活性即可恢复。酶的可逆性抑制作用可分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。竞争性抑制是指抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起的抑制作用。Vm不变，Km增大。非竞争性抑制是指抑制剂与底物分别与酶分子上的不同位点结合而引起酶活性降低的抑制作用。Vm减小，Km不变。反竞争性抑制是指抑制剂与底物和酶分子结合生成的中间复合物结合而引起的抑制作用。Vm和Km同时减小。（7）激活剂：能够增加酶的催化活性或使酶的催化活性显示出来的物质称为酶的激活剂或活化剂。无机离子和某些金属离子，如氯离子是唾液淀粉酶的激活剂，金属离子的激活作用主要是由于金属离子在酶和底物之间起了桥梁的作用，从而更有利于底物和酶的活性中心部位结合。小分子有机化合物EDTA是金属离子的螯合剂，能接触重金属离子对酶的抑制作用，也可作为酶的激活剂。第二章酶的发酵工程1.酶生物合成的几种模式：微生物细胞的生长过程一般经历调整期、生长期、平衡器和衰退期四个阶段。酶生物合成的模式分为4种类型，即同步合成型、延续合成型、中期合成型和滞后合成型。（a）同步合成型：酶的生物合成与细胞生长同步进行，又称为生长偶联型。该类型酶的生物合成可以由其诱导物诱导合成，但是不受分解物的阻遏作用，也不受产物的反馈阻遏作用。且该型酶所对应的的mRNA很不稳定。（b）延续合成型：酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。所对应的mRNA相当稳定。（c）中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。酶的合成受分解代谢物阻遏或产物的反馈阻遏。所对应的mRNA不稳定。（d）滞后合成型：只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点：受分解代谢物的阻遏作用。mRNA稳定性高。延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵温度。滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方面努力。2.分解代谢物阻遏：又称“葡萄糖效应”，指葡萄糖和其它容易利用的碳源，其分解代谢产物能阻遏某些酶（尤其是参与分解代谢的酶）合成的现象。分解代谢物阻遏产生的原因，一是葡萄糖等碳源分解氧化积累ATP，需消耗AMP，AMP浓度下降后胞内cAMP会水解生成AMP来补充。cAMP浓度降低使cAMP-CAP复合物减少，酶基因启动子上就没足够cAMP-CAP复合物结合，RNA聚合酶也就无法结合到启动子上，导致转录无法进行，酶合成受到阻遏。3.培养基成分问题：（1）碳源：提供能量，构成细胞的主要元素，如糖。（2）氮源：蛋白胨、硝酸铵。要注意碳氮比。（3）无机盐：主要作用是提供细胞生命活动所必不缺的各种无机元素，并对细胞内外的pH、氧化还原电位和渗透压起调节作用。（4）生长因素：是指细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物，主要包括各种氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶等。（5）产酶促进剂：某些表面活性剂能增加酶的产量，如添加0.1%吐温80，可提高多种酶的产量。一般采用非离子表面活性剂。第三章酶的分离工程1.分离纯化的机理：2.HPLC2.1特点（1）使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因而分辨率很高。（2）溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。固定相（柱填料）：常用坚硬、耐高压，粒度小的硅胶。2.2原理：HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。2.3分类（1）正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。（2）反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。2.4色谱仪组成进样系统、输液系统、分离系统、检测系统、数据处理系统3.超临界流体介质的形成、特点：超临界流体：温度及压力均处于临界点以上的液体叫超临界流体(supercriticalfluid，简称SCF)。处于一种既不同于气态，也不同于液态的新的流体态──超临界态。它是由于液体与气体分界消失，是即使提高压力也不液化的非凝聚性气体。常用超临界液态CO2作为萃取剂，因为液体CO2无毒，临界温度（304.06K）接近常温，临界压力（7.38MPa）较低，操作安全。超临界流体萃取的特点：（1）具有广泛的适应性；（2）萃取效率高，过程易于调节：超临界流体兼具有气体和液体特性，因而超临界流体既有液体的溶解能力，又有气体良好的流动和传递性能；（3）分离工艺简单，而且节省耗能；（4）分离过程有可能在接近室温下完成(二氧化碳)，特别适用于热敏性天然产物。第四章酶的固定化1.固定化酶的优点：酶的稳定性明显改善；酶的利用效率高；易于分离纯化；反应条件易于控制；适合于多酶催化反应。2.酶的固定化方法：2.1吸附通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上，从而制成固定化酶。固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等；优点：操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用；缺点：物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落。2.2包埋法包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合催化剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。多孔载体琼脂、聚酰胺、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶等。特点：不需要酶蛋白的氨基酸残基参与载体的结合，反应条件温和，很少改变酶结构，酶活力回收率较高。2.2.1凝胶包埋法：是将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化酶菌体。天然凝胶条件温和，操作简便，对酶活影响小，强度较差；合成凝胶强度高，耐温度、pH值变化强，因需聚合反应而使部分酶变性失活。适用性：不适用于底物或产物分子很大的酶类的固定化。2.2.2半透膜包埋法：将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。特点：半透膜、聚酰胺膜、火棉膜等，孔径几埃至几十埃（10-10米），比酶分子直径小，适用于底物和产物都是小分子的酶。微胶囊：半透膜包埋法制成的固定化酶小球，直径一般只有几微米至几百微米。2.3结合法选择适宜的载体，通过载体的共价键或离子键(非共价健)与酶结合在一起的固定化方法。2.3.1离子键结合法载体：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等不溶于水的离子交换剂操作：将酶液与载体混合搅拌几个小时或将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱；特点：活力损失少，结合力较弱，条件(pH值和离子强度)改变时，酶易脱落。2.3.2共价键结合法载体分类：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等；分三类：天然有机载体(多糖、蛋白质）、无机物（玻璃、陶瓷）、合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙）。载体活化：借助某种方法，在载体上引进某一能与酶分子上某一基团反应的活泼基团。优点:结合很牢固，酶可连续使用较长时间。缺点:操作复杂，共价结合可能影响酶的空间构象而影响酶的催化活性，共价反应固定时酶活力有损失。活化方法：重氮法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法。重氮法：将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸活化，生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团再与酶分子上酚基和咪睉基共价偶联。叠氮法：含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物，再与羟基、巯基偶联。溴化氰法：含有羟基的载体，如纤维素等，可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物，再与酶氨基偶联。烷基化法：含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。2.4交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构。特点：此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是不使用载体。双功能试剂：戊二醛、己二胺、双偶氮苯等。戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应,使酶蛋白交联。优点：结合牢固，可以长时间使用。缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基团被交联，酶活损失大，颗粒较小，使用不便，双重固定化将其与吸附法、包埋法联合使用。分类：（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶。优点：用吸附法、包埋法固定化酶时，一般很容易造成酶的泄漏，因此常常在包埋或吸附固定化的同时，采用戊二醛进行交联。无载体固定化中的交联溶解酶，其机械强度欠佳，可以采用进一步包埋的方法弥补这一缺陷。2.5热处理法在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体体内，适用于热稳定性较好的酶的固定化，严格控制加热及其时间。3各种固定化方法的优缺点比较吸附法：条件温和、方法简便、载体可再生。但操作稳定性差。共价法：操作稳定性高。但由于试剂的毒性，易引起酶的破坏。交联法：可得到高酶浓度，酶活损失大、机械强度低，不适于实际应用。包埋法：酶和载体间没有束缚，固定化后，酶仍保持较高活力。但这类方法只适用于小分子底物。4固定化细胞4.1固定化细胞的定义：固定在载体上并在一定空间范围内能进行生命活动的细胞。4.2分类：固定化死细胞，包括固定化完整的死细胞、细胞碎片甚至细胞器，主要适用于一种酶催化的反应。固定化活细胞，包括增殖细胞、静止细胞、饥饿细胞，其适用于多酶反应体系，特别是需要辅酶再生的反应体系。固定化动物细胞的特点：提高细胞存活率，提高产率，可悬浮培养，提高细胞生长密度，易于料液分离。微载体悬浮培养：动物细胞微载体上固定，贴壁生长，微载体培养器中悬浮培养。5动物细胞培养5.1动物细胞生长的特点无细胞壁，敏感脆弱；体积中等；具群体效应，贴壁生长；营养要求复杂，维生素，激素，生长因子，血清。定义：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。5.2进行生产的动物细胞培养方式：悬浮培养：瘤细胞、淋巴细胞；贴壁培养：滚瓶培养、玻璃瓶、塑料瓶微载体培养：葡萄糖凝胶；固定化细胞培养第五章酶分子修饰1金属离子置换修饰1.1定义：把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法，称为金属离子置换修饰。酶分子中的金属离子取代可以改变酶的专一性、稳定性及其抑制作用。若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。1.2过程酶的分离纯化，除去原有的金属离子，加入置换离子。2酶分子表面化学修饰2.1化学固定化一般是通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的环境的改变，会使酶的性质，特别是动力学性质发生改变。2.2酶的小分子修饰作用用小分子修饰剂共价修饰酶，可使酶稳定性提高。这主要是利用一些适宜的小分子修饰剂来修饰酶表面的一些基团：—COOH