酶工程实验2

实验一动物血中超氧化物歧化酶的提取一、实验原理l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。从动物血液材料中制备CuZn-SOD纯化工艺分为三个主要步骤：（1）原材料的预处理；（2）粗酶液的制备；（3）离子交换柱层析精制。国内多采用Mccord和Fridovich法，其主要工艺过程为：第一步，乙醇-氯仿除去血红蛋白；第二步，有机溶剂和硫酸铵分级沉淀；第三步，离子交换柱层析精制。二、试剂和器材1、试剂（1）3.8%（质量分数）柠檬酸三钠（2）0.9%（质量分数）氯化钠（3）预冷95%（体积分数）乙醇（4）预冷氯仿（5）预冷丙酮（6）pH7.6、2.5mmol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液（7）猪血2、器材（1）恒温水浴锅（3）离心机（4）布氏漏斗、抽滤瓶（5）烧杯、量筒、搅棒（6）透析袋（7）低温层析柜（8）制冰机（9）黑色保温桶（10）移液枪三、方法和步骤（1）分离血球取新鲜猪血180ml，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4000r/min离心20min，收集红血球。（2）除血红蛋白红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1.5倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后4000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，（记录体积，预留2ml用于测酶活性和蛋白浓度）。（3）热变性上清液加热到65℃，保温10min，然后迅速冷却到室温，3000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液，（记录体积，预留2ml测酶活性和蛋白浓度）。（4）沉淀上清液在冰浴中冷却，然后在低温（冰浴）下，加入1.5倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置2～3min，迅速4000r/min离心2min，弃去上清液得肉色沉淀。沉淀物用1ml蒸馏水溶解，4000r/min离心20min，除去不溶物，清液转移至透析袋中，用pH7.6的2.5mmol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液4℃透析过夜，即得粗SOD溶液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。四、结果与计算1、计算每步操作所得酶液的酶活性、蛋白浓度和比活力。2、计算每步操作的酶活性回收率、蛋白回收率和纯化倍数。实验二超氧化物歧化酶的活性测定一、实验原理SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2-，利用SOD分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。亚硝酸盐形成法与CN—抑制剂或SDS处理相结合，应用于Mn-SOD测定，灵敏度比Cyte还原法提高数倍，而且专一性强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是目前较好的测定方法之一。在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。本实验采用邻苯三酚自氧化方法。邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。二、试剂和器材1、试剂（1）pH8.2、50mmol/LTris-HCl称取Tris0.61g，EDTA-2Na0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右，用HCl调节pH=8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。（2）10mmol/LHCl（3）50mmol/L邻苯三酚称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/LHCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。（4）SOD样液2、器材（1）恒温水浴槽（2）紫外分光光度计（3）试管、刻度吸管、微量注射器三、方法和步骤1、邻苯三酚自氧化速率的测定取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/LHCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。试剂空白管（mL）自氧化管（mL）pH8.2、50mmol/LTris-HCl2.982.9810mmol/LHCl0.020.0150mmol/L邻苯三酚-0.012、SOD样液的活性测定样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。试剂空白管（mL）样品管（mL）pH8.2、50mmol/LTris-HCl2.982.9810mmol/LHCl0.02-SOD样液-0.0150mmol/L邻苯三酚-0.01（3）计算样液体积样液稀释倍数反应液总体积样液速率）酶活性（%50%100070.0070.0/mLU实验三福林—酚法测定蛋白质含量一、实验目的福林—酚法是双缩脲法的发展，它是一种灵敏度极高的快速测定蛋白质含量的方法，广泛用于水溶性蛋白质含量测定。二、实验原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。三、仪器与试剂仪器：（1）752型分光光度计（2）电子天平（3）水浴锅（4）试管、小烧杯、移液管、100ml容量瓶（5）漏斗、漏斗架、滤纸试剂：（1）牛血清蛋白(bovineserumalbumin．BSA)标准溶液：于分析天平上精确称取0.0500g结晶牛血清白蛋白，于小烧杯内容姐后转入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容，即成为500μg/mL的标准蛋白质溶液。（2）福林—酚试剂甲：试剂A：10g碳酸钠(Na2CO3)，2g氢氧化钠和0.25g酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O)溶解后用蒸馏水定容至500mL。试剂B：0.5g硫酸铜(CuSO4·H2O)溶解于100mL蒸馏水中。每次使用前，将试剂A、B两种溶液按50：1的比例混合，即为福林—酚试剂甲。该试剂只能用1天，过期失效。（3）福林—酚试剂乙：购买(纯度99％)。四、测定方法（1）标准曲线的绘制。取7支试管，按下表加入溶液：向各管加试剂甲5ml，混合后在室温下放置10min，再加试剂乙0.5ml，立即混匀。30min后，于750nm波长处以1号管为对照调零，测定其余6支试管的吸光值（A）。以牛血清蛋白含量（ug）为横坐标，以吸光值（A）为纵坐标，绘制标准曲线。（2）样品蛋白质量浓度的测定：取2支试管，一支加入1.0ml待测液，一支加蒸馏水1.0ml作空白对照。向两支试管中分别加试剂甲5ml，混匀后室温放置10min，加试剂乙0.5ml，立即混匀，30min后于750nm波长处测定吸光值，做好记录，在标准曲线上查出蛋白质含量（C）。五、计算蛋白质含量（%）=610WAC试管编号1234567加标准液量（ml）00.10.20.40.60.81.0加H2O量（ml）1.00.90.80.60.40.20蛋白质含量（ug）050100200300400500C—查标准曲线所得蛋白质含量（ug）A—稀释倍数W—样品重（g）106—将微克换算为克