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吉林农业大学酶工程实验实习报告实验名称：α-淀粉酶的固定化研究小组成员：院系：生命科学学院专业班级：指导教师：职称：2014年6月26日α-淀粉酶的固定化研究葛明昊常颖崔龙何晓敏孟凡琨指导教师：朱学军摘要：本实验比较了以卡拉胶和海藻酸钠为载体对α-淀粉酶进行固定化的效果，经试验最终采用以海藻酸钠为载体，采用包埋法制备固定化α－淀粉酶，通过单因素试验确定最优的固定化α－淀粉酶的条件。利用戊二醛作为再固化交联剂，进一步探究了包埋交联法进行固定化酶的条件，制备性质更为稳定的固定化酶。结果表明，最优工艺为海藻酸钠3％，氯化钙4％，戊二醛5%，交联时间2h。在此条件下，得到的固定化酶的温度稳定性、pH稳定性以及底物浓度适应性均优于游离酶。关键词：海藻酸钠；α-淀粉酶；固定化；戊二醛α－淀粉酶（α－1，4－D－葡萄糖－葡萄糖苷水解酶）普遍存在于动物、植物和微生物中，它能以随机作用的方式切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的α－1，4葡萄糖苷键，产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，被广泛应用于食品加工、粮食工业、乙醇工业、发酵和纺织业等多种行业，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。固定化酶与游离酶相比，具有热稳定性高、保存稳定性好、对变性剂耐受性强等优点，可重复或连续使用，且易于与产品分离，是食品、医药、化工等领域的研究热点之一。依据酶的性质和用途，酶的固定化方法主要可以分为以下4种：吸附法、交联法、包埋法和共价结合法。酶的固定化可以使用多种载体，其中海藻酸钠是一种从海藻中提取的亲水性胶态多聚糖，它是由β－（1，4）－D－甘露糖醛酸和α－（1，4）－L－古罗糖醛酸组成的线性高分子化合物，其分子含有自由的羧基和羟基，可溶于不同温度的水中，生物相容性好，稳定、无毒、成膜性或成球性好，是常用的囊材与载体材料，也常被用作固定化酶的载体。本试验采用海藻酸钠包埋交联法制备固定化α－淀粉酶，得到最佳的固定效果，并对游离酶和固定化酶的酶学性质进行了比较。1材料与方法1.1仪器与材料仪器：恒温水浴锅、抽滤装置、电子天平、722型可见分光光度计、容量瓶50ml、容量瓶100ml、容量瓶250ml、三角瓶、烧杯、量筒、吸量管、洗耳球、玻璃棒、注射器、刻度试管材料：海藻酸钠、卡拉胶、α-淀粉酶、淀粉、麦芽糖、磷酸氢二钠、柠檬酸、去离子水、CaCl2、3、5-二硝基水杨酸、NaOH、戊二醛1.2方法1.2.1麦芽糖含量标准曲线的绘制取25ml刻度试管7个，编号，分别加入麦芽糖标准溶液（1mg/ml）0,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后于各管加蒸馏水达2ml，再加3,5-二硝基水杨酸试剂2ml，置沸水浴中准确煮沸5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至25ml，用722型分光光度计在520nm的波长下进行比色，记录消光值，以消光值为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标制标准曲线。1.2.2利用卡拉胶进行α-淀粉酶的固定化将0.5g酶溶于50ml蒸馏水中，搅拌溶解后，分别取10ml酶液加入90ml2.0%的卡拉胶溶液中，用玻璃棒混匀。将卡拉胶-酶混合液移入注射器中，适度加力，将卡拉胶-酶液滴入2%KCl2溶液中。滴完，将三角瓶移入20-22℃水浴中放置30min，倾去溶液，加入100ml无菌去离子水冲洗2-3次。过滤，用滤纸适当吸干沉淀中的水分，，储存于4℃冰箱中备用。1.2.3利用海藻酸钠进行α-淀粉酶的固定化将0.5g酶溶于50ml蒸馏水中，搅拌溶解后，分别取10ml酶液加入90ml2.0%的海藻酸钠溶液中，用玻璃棒混匀。将海藻酸钠-酶混合液移入注射器中，适度加力，将海藻酸钠-酶液滴入4%CaCl2溶液中。滴完，将三角瓶移入20-22℃水浴中放置30min。倾去溶液，加入100ml无菌去离子水冲洗2-3次。过滤，用滤纸适当吸干沉淀中的水分，储存于4℃冰箱中备用。1.2.4吸附交联法固定α-淀粉酶将利用包埋法固定化α-淀粉酶的小球取出置于烧杯中，加入2%的戊二醛溶液，交联2h后滤出小球，用去离子水冲洗2-3次，过滤，用滤纸适当吸干沉淀中的水分，，储存于4℃冰箱中备用。1.2.5α-淀粉酶活力的测定取6个试管，编号，前5只为试验管，第6只为对照管。向各管分别加入1ml1mg/ml的游离酶液。向6只试管分别加入1mlpH为7的柠檬酸缓冲液。向对照管内加入4ml0.4mol/L的NaOH溶液，以钝化酶的活性。将各管置40℃（±0.5℃）恒温水浴中保温15min，再分别向各试验管加入40℃下预热的浓度为1.0%的淀粉溶液2ml，向对照管加入40℃下预热的浓度为1.0%的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5min后取出，向各测定管中迅速加入4ml0.4mol/L的NaOH溶液，以终止酶活后准备下步测定。取出以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各2ml，分别放入具塞刻度试管中，再加入2ml3,5-二硝基水杨酸混匀，置沸水浴中准确5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用722型分光光度计在520nm的波长下进行比色，记录消光值，从麦芽糖标准曲线中计算出麦芽糖含量，用以表示酶活性。酶的相对酶活是指在同一组试验中，以活性最高的一组为100，其余的酶活力与之相比，计算百分数。酶的固定效率=（固定化酶的活力/加入的总酶活力）×100%1.2.6单因素试验确定固定化酶固定方法以固定化酶的相对酶活为考察指标，探讨海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、戊二醛浓度和交联时间对固定化酶活性的影响。①不同浓度海藻酸钠对固定化酶活性的影响。当氯化钙浓度为4％，戊二醛浓度为2％，交联2h，考察不同浓度的海藻酸钠（1％、2％、3％、4％、5%）对固定化酶活性的影响。②不同浓度氯化钙对固定化酶活性的影响。当海藻酸钠浓度为2％，戊二醛浓度为2％，交联2h，考察不同浓度的氯化钙（2％、3％、4％、5％、6%）对固定化酶活性的影响。③不同浓度戊二醛对固定化酶活性的影响。当海藻酸钠浓度为2％，氯化钙浓度为4％，交联2h，考察不同浓度戊二醛（3％、4％、5％、6％、7%）对固定化酶活性的影响。④不同交联时间对固定化酶活性的影响。当海藻酸钠浓度为2％，氯化钙浓度为4％，戊二醛浓度为2％，考察不同交联时间（0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h）对固定化酶活性的影响。1.2.7游离酶固定化后性质的对比通过单因素实验分别确定了游离酶和固定化酶的最适pH、最适底物浓度、最适反应温度，并进行了比较①最适pH取6个试管，编号，前5只为试验管，第6只为对照管。向各管分别加入1ml1mg/ml的游离酶液。前5只试验管分别加入1mlpH为5.0,6.0,7.0,8.0,9.0的柠檬酸缓冲液，向对照管加入1mlpH为7的柠檬酸缓冲液。向对照管内加入4ml0.4mol/L的NaOH溶液，以钝化酶的活性。将各管置40℃（±0.5℃）恒温水浴中保温15min，再向各试管加入40℃下预热的1%的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5min后取出，向各测定管中迅速加入4ml0.4mol/L的NaOH溶液，以终止酶的活性后测定酶活。②最适底物浓度取6个试管，编号，前5只为试验管，第6只为对照管。向各管分别加入1ml1mg/ml的游离酶液。向6只试管分别加入1mlpH为7的柠檬酸缓冲液。向对照管内加入4ml0.4mol/L的NaOH溶液，以钝化酶的活性。将各管置40℃（±0.5℃）恒温水浴中保温15min，再分别向各试验管加入40℃下预热的浓度为0.5%,1.0%,1.5%,2.0%,2.5%的淀粉溶液2ml，向对照管加入40℃下预热的浓度为1.0%的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5min后取出，向各测定管中迅速加入4ml0.4mol/L的NaOH溶液，以终止酶的活性后测定酶活。③最适反应温度取6个试管，编号，前5只为试验管，第6只为对照管。向各管分别加入1ml1mg/ml的游离酶液。向6只试管分别加入1mlpH为7的柠檬酸缓冲液。向对照管内加入4ml0.4mol/L的NaOH溶液，以钝化酶的活性。将各管置40℃（±0.5℃）恒温水浴中保温15min，再分别向各试管加入40℃下预热的浓度为1.0%的淀粉溶液2ml，摇匀，立即将各试验管分别放入35℃，45℃，55℃，65℃，75℃水浴中，将对照管放入40℃水浴中，准确保温5min后取出，向各测定管中迅速加入4ml0.4mol/L的NaOH溶液，以终止酶的活性后测定酶活。固定化酶的试验方法是将上述方法中的α-淀粉酶溶液替换为等游离酶量的固定化酶颗粒，其余条件不变进行试验。2结果与分析2.1固定化α－淀粉酶载体选择本实验拟采用卡拉胶和海藻酸钠作为载体对α-淀粉酶进行固定化，但在实验进行中发现，用卡拉胶对α-淀粉酶进行包埋时，随着卡拉胶浓度的提升，其凝结温度也随之提高，当配置卡拉胶浓度为2.5%及以下进行包埋时，其凝结温度可以控制在65℃以下，但在该浓度下，固定化酶无法成球，在滴入氯化钾溶液后呈絮状，很难提取出来；当配置卡拉胶浓度为3%及以上时，为保证不凝结需保持温度在80℃及以上，此时酶活性会明显降低，且在固定化过程中很容易凝结在针管中，导致卡拉胶难以挤出，因此，我们选用海藻酸钠进行α-淀粉酶的固定化。2.2固定化α－淀粉酶的单因素试验2.2.1不同浓度海藻酸钠对固定化酶活性的影响分别取浓度为1％、2％、3％、4％、5%的海藻酸钠溶液进行试验，结果见图1由。图1可知，随海藻酸钠浓度的升高，固定化酶火星随之升高，当海藻酸钠浓度为3％时，固定化酶活性最大，当海藻酸钠浓度继续增大时，其黏度增大，难以挤压成球状，并且所形成的凝胶小球体积过大，影响酶与底物充分结合。图1不同浓度海藻酸钠对固定化酶活性的影响2.2.2不同浓度氯化钙对固定化酶活性的影响分别取浓度为2％、3％、4％、5％、6%的氯化钙溶液进行试验，结果见图2。由图2可知，固定化酶活性在氯化钙浓度变化范围内先增加而后逐渐降低。当氯化钙浓度为4％时，固定化酶相对活性最高，固定效果最佳。当氯化钙浓度逐渐增加时，固定化酶的直径随之减小。推测可能是海藻酸钠中的α－（1，4）L－古罗糖醛酸结构与钙离子交联形成蛋盒（egg－box）结构，氯化钙主要影响的是交联程度，其浓度越高，固定化酶结构的致密程度越高，因此浓度大的氯化钙会降低固定化酶的活性与直径。图2不同浓度氯化钙对固定化酶活性的影响2.2.3不同浓度戊二醛对固定化酶活性的影响分别取浓度为3％、4％、5％、6％、7%的戊二醛溶液进行试验，结果见图3。由图3可知，当戊二醛浓度为5％时，吸附交联效果最佳。固定化酶活性随戊二醛浓度的增加逐渐升高，当戊二醛浓度超过5％时，固定化酶活性降低。图3不同浓度戊二醛对固定化酶活性的影响2.2.4不同交联时间对固定化酶活性的影响将包埋固定化酶小球放入5%戊二醛溶液中1h、1.5h、2.0h、2.5h、3h进行交联，结果见图4。由图4可知，当交联时间为2h时，吸附交联效果最佳。固定化酶活性随交联时间增加逐渐升高，当交联时间超过2h时，固定化酶活性降低。图4不同交联时间对固定化酶活性的影响2．3固定化酶与游离酶的酶学性质比较2．3．1pH对固定化酶与游离酶活性的影响在最佳工艺条件下，取pH5、6、7、8、9，测定游离酶与固定化酶的活性，试验结果见图5。由图5可知，游离酶和固定化酶的最适反应pH均为6．0，与游离酶相对活性相比，固定化酶的相对酶活变化幅度不大，即固定化酶在pH变化范围内能够保持相对较高的酶活，相比游离酶具有更宽的适应性。图5pH对固定化酶与游离酶活性的影响2．3．1底物浓度对固定化酶与游离酶活性的影响在最佳工艺条件下，取底物浓度为1.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的淀粉溶液，测定游离酶与固定化酶的活性，试验结果见图6。由图6可知，游离酶和固定化酶的最适底物浓度均为1.5%的淀粉溶液，与游离酶相对活性相比，固定化酶的相对酶活变化幅度不大，即固定化酶在底物浓度变化范围内能够保持相对较高的酶活，相比游离酶具有更宽的适应性。同时，由实验结果可见，低浓度底物浓度范围内，随底物浓度的升高，