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酶活力的表示方法活力单位（activeunit）习惯单位（U）:底物(或产物)变化量/单位时间国际单位（IU）:1μmoL变化量/分钟Katal（Kat）：1moL变化量/秒比活力=总活力单位总蛋白mg数=U(或IU)mg蛋白量度酶催化能力大小量度酶纯度比活力（specificactivity）回收率和纯化倍数回收率＝×100％每次总活力第一次总活力纯化倍数＝每次比活力第一次比活力1kSE1kES2kEP第二章产酶微生物的分离和选育1.1产酶微生物1.2分离和筛选1.3诱变育种1.4基因育种程育种1.5原生质体融合育种教学内容1.1产酶微生物微生物产酶的优势1、种类多，产能高，酶种类多样化2、周期短，繁殖快，培养简单、成本相对低3、易突变，易选育获得高产菌株4、易进行基因工程改造·从自然界中分离出来直接利用；·对野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能利用。·使用重组DNA技术改造的菌株从野生菌转向变异菌；自然选育转向代谢育种；诱发基因突变转向基因重组的定向育种目前育种总趋势：工业生产常用的微生物：细菌、放线菌、酵母菌、霉菌51、细菌2、放线菌属原核单细胞生物，有球菌、杆菌和螺旋菌三类，分革兰氏阳性菌和阴性菌。在发酵专业中常用的是杆菌，它易形成芽孢。属原核生物，菌落呈放射状，广泛存在于泥土中，最大经济价值是用来生产抗生素。3、霉菌属真核生物，俗称丝状真菌。在发酵工业、农业、食品和皮革等方面有重要用途，但易引起工业原料、产品和农副产品的发霉变质。4、酵母菌属真核单细胞生物，主要生长在偏酸含糖量较高的环境中，酒精、饮料等生产中有重要用途。1.1.1产酶微生物的种类6工业生产常用的细菌有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)乳酸杆菌(Lactobacilluslactics)醋酸杆菌(Acetobacter)棒状杆菌(Corynebacterium)短杆菌(Brevibacterium)用于生产：生产淀粉酶(amylase）蛋白酶（proteinase）乳酸(lacticacid)醋酸(aceticacid)氨基酸(aminoacid)肌苷酸(inosinicacid)细菌（bacteria）：基因工程常用宿主（工程）菌之一。7放线菌(Actinomycetes)常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等。最大经济价值在于能产生多种抗生素（antibiotics）。从微生物中发现的抗生素，有60%以上是放线菌产生的，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。8酵母菌（yeast）工业上用的酵母菌有：啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、假丝酵母(Candida)、类酵母(Saccharomycodes)等用于酿酒(Brewing)、制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶（lipase），以及生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。基因工程常用宿主（工程）菌之一。9霉菌（mould）工业上常用的霉菌有：藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等；产品：酶制剂（enzymepreparation）、抗生素(antibiotic)、有机酸（organicacid）及甾体激素（steroidhormone）等。10几种菌落11常见酶蛋白酶酸性蛋白酶中性蛋白酶碱性蛋白酶糖化酶淀粉酶脂肪酶纤维素酶1.1.2微生物酶的种类医药与分析研究用酶青霉素酰化酶SOD溶栓酶透明质酸酶121.1.3产酶微生物的来源向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种•土壤•水体•空气•极端环境13菌落数与空气清洁度的关系空气清洁度菌落数最清洁的空气1洁净空气30个以下普通空气30-150轻度污染空气300以下严重污染空气301以上14微生物工业对菌种的要求P55作为大规模生产，对菌种有下列要求：(1)产酶量高、易分离。(2)易于控制培养条件，酶活性高；发酵周期较短。(3)非致病菌、不产生任何有害的物质和毒素，(4)菌株稳定、抗杂菌和抗噬菌体能力强。15分离思路•新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。•实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。•有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。第二节产酶微生物的分离和筛选从自然界筛选17•定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。•采样：有针对性地采集样品。•增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。•分离：利用分离技术得到纯种。•发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。新种分离与筛选的步骤（P56）（一）样品采集从大自然中分离筛选新的微生物菌种纤维素酶：堆积和腐烂纤维素区域，如腐烂树干上；果胶酶：霉烂果蔬淀粉酶：酿酒厂、淀粉厂周围土壤、污泥、排水中蛋白酶：屠宰场、豆制品厂污泥中。土壤分离为主要来源：~15cm处土壤19农田上层15cm处微生物的数量微生物每克土壤中的数量细菌9.8×107放线菌2.0×106真菌1.2×105藻菌2.5×104原生动物3.0×104方法：3~5个取样点、~10g/点，混合后于灭菌纸袋中，标记：地点、日期、土壤性质、植被情况及pH。采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。20方法•为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。•样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。1．土样采集方法•森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；•水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5～15cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。2．植物体采集方法•在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。•选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。•采集植物根及根系时，将洗净的根装入采样袋中。3．水样采集方法•用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。•由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。•方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。（二）增殖培养为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。富集方法1、添加特殊的营养物质2、调整培养基的酸碱性3、控制培养温度和热处理4、添加抑制剂（三）培养分离•尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。1.稀释平皿分离法1.稀释平皿分离法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀释1.稀释平皿分离法b.涂布平皿分离法a.倾注平皿分离法2.平皿划线分离法a.连续划线分离法b.分区划线分离法（四）筛选•这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。（五）毒性试验自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。优良菌种应具备的特征•对菌种的要求天然菌种的生产性能较低，一般需要进行选育。1.生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产物的产量高，其它代谢产物少2.操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离3.稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退化4.安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素优良菌种应具备的特征•选择生产菌种应注意的因素1.原料方面：广，转化率高；2.产物方面：目的产物含量高，副产物少；3.菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强，抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定4.设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。（培养条件异，周期短，需氧量小，抗污染能力强）从自然界中分离筛选菌种的方法步骤采样增殖培养纯种分离纯培养生产性能测定方法、地点、时间和周围环境记录纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：1．稀释分离法2．平板划线分离法⑴涂菌：⑵划线分离：①分步划线法；②一次划线法：3．组织分离法测定代谢产物或其它目的性状二、诱变剂和诱变处理物理诱变剂：物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。化学诱变剂：如碱基类似物、烷化剂等。ｐｓ：化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。1.使用经济方便2.专一性不同药剂对不同植物、组织或细胞、染色体节段、基因的诱变有一定专一性。3.诱变机制与辐射育种不同辐射诱变因高能射线造成，染色体结构变异广泛化学诱变是化学药剂与遗传物质发生生化反应，结果多是基因的点突变，所以更为适用。注意：致癌剂三、诱变育种步骤•出发菌株的选择•处理菌悬液的制备•诱变处理•筛选•保藏2.制备细胞悬液要求：①菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长；②细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象（phenotypiclag）;方法：①玻璃珠打散10-15min;②加０.3%吐温80（表面活性剂）③用无菌脱脂棉过滤。制备：物理诱变剂——生理盐水（0.85%NaCl)化学诱变剂——缓冲液浓度：细菌、放线菌108个/ml霉菌、酵母菌106个/ml指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在表型上显示出来，造成不纯的菌落。①分离性迟延现象②生理性迟延现象why3.诱变处理：诱变剂的作用：①提高突变的频率②扩大产量变异的幅度③使产量变异朝着正突变或负突变移动剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。—致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在70~80%）选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便。化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反应的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种较有效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上出发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经培养后，在制菌圈的边缘挑取若干突变菌落，分别制成悬浮液，然后将其涂在一般平板表面使长出许多单菌落，最后可用影印培养法或逐个检出法选出突变种。筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。透明圈法：混浊底