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酶的提取：取不同发育时期决明子幼芽根、茎、叶或幼芽各1g于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷酸缓液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为2ml。取2ml于4℃10000r/min离心20min上清液即为酶粗提液。过氧化物酶（POD）活性的测定（比色法）一、原理：过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，此产物在470nm处有最大光吸收值，故可通过测470nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。（1）100mmol/L磷酸缓冲液（pH=6.0）：[0.2M的Na2HPO412.3mL和NaH2PO487.7mL混合后稀释2倍]（2）反应混合液：100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50ml于烧杯中，加入愈创木酚28μl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19μl，混合均匀，保存于冰箱中。四、操作步骤取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3mL和磷酸缓冲液1mL（或加热煮沸5min的酶液），作为校零对照，另1只中加入反应混合液3ml，上述酶液1ml（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上在波长470nm下测量吸光度值，每隔0.5min（30S）读数一次，连续读数3次。五、结果计算：以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U）式中：△A470——反应时间内吸光度的变化；W——植物鲜重（g）；t——反应时间（min）；VT——提取酶液总体积（mL）；VS——测定时取用酶液体积（mL）。六、注意事项酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行。H2O2要在反应开始前加，不能直接加入。氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性一、实验目的1、了解氮蓝四唑（NBT）法测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的基本原理。2、掌握氮蓝四唑（NBT）法测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的基本操作方法。二、实验原理超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。三、试剂（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。91.5ml0.05MNa2HPO4+8.5ml0.05MNaH2PO4。（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。（4）100µmol/LEDTA-Na2溶液：称取0.03721gEDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。（5）20µmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。四、实验步骤1、显色反应取10mL试管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入各种溶液：各溶液显色反应用量混匀后将1支对照管置暗处，其他各管于4000lx日光下反应20min（要各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。2、SOD活性测定与计算至反应结束后，全部移入暗处，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管的吸光度。注意：用放在暗处的缓冲液代替酶液的空白管调零，各试剂按比例混合好（3.5ml缓冲液+0.5ml甲硫氨酸+0.5ml氮蓝四唑+0.5mlEDTANa2+0.40ml蒸馏水），再加100ul酶液，核黄素0.5ml最后单独加入。总体积6.0mL五、结果计算计算公式：SOD（U/g.FW）=(Ack-AE)*VT/Ack/0.5/W/Vs式中VT-总酶液量（ml）Vs-所用酶液量（50ul）W-叶片鲜重（g）Ack-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度AE-样品管吸光度过氧化氢酶（CAT）活性测定（1）试剂配制：0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4)457.5ml和B母液(NaH2PO4)292.5ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。（2）反应液配制：取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2（原液）摇匀即可。（3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）。（4）酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。CAT=[ΔA240×Vt]/（W×Vs×0.01×t）(u/gmin)ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml,0.1ml）。