酶活性测定方法汇编

1酶活性测定方法汇编一、过氧化氢酶活性的测定——J.L.Johnson和K.L.Temple法1.主要试剂（1）3%过氧化氢，临时配制（2）3N硫酸：8.4ml浓硫酸溶于水，定容至100ml。（3）0.1N高锰酸钾：3.161g高锰酸钾（AR）溶于水，定容至1000ml，于棕色瓶中保存。2.操作步骤称取2.0g过1mm筛孔的风干土壤于125mm的三角瓶中，注入40ml蒸馏水，5ml0.3%过氧化氢，振荡20分钟，加入5ml3N硫酸，用滤纸过滤；吸取25ml滤液于100ml三角瓶中，用0.1N高锰酸钾滴定至微红色（30秒不变），记录高锰酸钾用量V1。同时作对照（不加土壤）试验，高锰酸钾用量为V2。3.结果计算：Ｍ(0.1mol/LKMnO4ml/g土)＝（V2—V1）T/gT为校正值二、蛋白酶活性的测定——G.Hoffman和K.Teicher法1.主要试剂（1）2%白明胶水溶液。（2）甲苯（3）CaCO3（4）青色溶液：10gCu(NO3)2*H2O溶于700ml水中，加入250gCH3COONa•3H2O，定容。（5）甘氨酸标准溶液：267.9mg甘氨酸溶于水，定容至1000ml(50µg/ml氨态氮)。（6）标准曲线：取0~20ml甘氨酸标准溶液，加入20ml水，加2ml铜溶液，比色测定。2.操作步骤称取10.0g过1mm筛孔的风干土壤于100mlL量瓶中，加入500mg碳酸钙，1.5ml甲苯。15分钟后，加入20ml2%白明胶溶液。混合均匀，在37℃恒温箱中放置20小时，用38℃热水稀释至刻度。同时用水代替白明胶作对照。过滤，吸取10ml滤液于50ml三角瓶中，加入10ml水和2ml铜溶液，定容。用4cm比色皿于650nm处与标准溶液一起测定.3.结果计算M(NH2-Nmg/g土)=(X样品-X对照-X无基质)×25÷102三、脲酶活性的测定——E.Hofmann与W.Schmidt法1.主要试剂（1）10%尿素。（2）甲苯。（3）磷酸盐缓冲液：（pH6.7），368g柠檬酸溶于600ml水中，加入1000ml29.5%KOH溶液，定容至2000ml。2.操作步骤：称取10.0g过1mm筛孔的风干土壤于100mlL量瓶中，用1.5ml甲苯处理。15分钟后，加入10ml10%尿素溶液和10ml磷酸盐缓冲液，混合均匀，在37℃恒温箱中放置48小时，用38℃热水稀释至刻度。同时用水代替基质作对照。过滤，吸取10ml滤液于100ml量瓶中，按氨电极法测定NH2-N的含量。3.结果计算M(NH2-Nmg/g土)=(X样品-X对照-X无基质)×100÷10四、酸性磷酸酶活性的测定G。Hoffmann法1.主要试剂（1）甲苯。（2）苯磷酸二钠溶液：6.75g苯磷酸二钠(C6H5PO4Na*2H2O)用水溶至1000ml(1ml含25mg酚)（3）醋酸盐缓冲液(pH5.0)：①0.2mol醋酸溶液：11.55ml醋酸用水溶至1000ml。②0.2mol醋酸钠溶液：16.4g无水醋酸钠用水溶至1000ml。取14.8ml①0.2mol醋酸溶液+35.2ml②0.2mol醋酸钠溶液加水至1000ml。（4）Gibbs试剂：200mg2，6-双溴苯醌氯酰亚胺(C6H2Br2ClNO)用乙醇溶至100ml。（5）酚标准溶液：①原液：1g酚用水溶至1000ml，保存在暗色瓶中。②工作液：取10ml原液用水定容至1000ml（1ml含10µg酚）。2.操作步骤：称取10.0g过1mm筛孔的风干土壤于100mlL量瓶中，用1.5ml甲苯处理。15分钟后，加入10ml苯磷酸二钠溶液和10ml醋酸盐缓冲液(pH5.0),混合。在37℃恒温箱中放置24小时，用38℃热水稀释至刻度。同时用水代替基质作对照。过滤，吸取10ml滤液于50ml量瓶中，加水至25ml,加入1mlGibbs试剂,混合均匀,放置20分钟,用水定容至刻度，在分光光度计上于578nm处测定颜色的深度。3.结果计算：M(phenolmg/g土)=(X样品-X对照-X无基质)×100÷10五、多酚氧化酶的测定1.A.гапстяи法（1）主要试剂①乙醚。②1%1,2,3-邻苯三酚溶液：10g1,2,3-邻苯三酚溶液溶于1000水中。3③0.5N盐酸。④重铬酸钾标准液：0.75g重铬酸钾溶于1000ml0.5N盐酸中，此溶液相当于50ml醚中含5mg没食子素。标准曲线：取6个容量瓶，分别加入1，2，5，10，20ml和50ml重铬酸钾标准液,用0.5N盐酸定容至刻度,每50ml工作液中分别相当含有没食子素为0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0mg，在分光光度计上于430nm处测定颜色的深度。（2）操作步骤：称取1.0g过1mm筛孔的风干土壤于50mlL量瓶中，加入10ml1%1,2,3-邻苯三酚，摇动均匀，于30℃恒温烘箱中放置3小时。加入乙醚至刻度，用力摇动均匀，将着色乙醚在分光光度计上于430nm处测定颜色的深度。同时作对照试验和无基质(用水代替基质)试验。（3）结果计算：M(phenolmg/g土)=(X样品-X对照-X无基质)×1002.K.Ａ.Koslov法（1）主要试剂①0.1%抗坏血酸溶液。②0.02M邻苯二酚溶液。③10%H3PO4。④1%淀粉溶液。⑤0.01N结晶碘标准溶液(用乙醇溶解)。（2）操作步骤：称取5.0g过1mm筛孔的风干土壤于试管中，加入2ml0.1%抗坏血酸溶液，1ml0.02M邻苯二酚溶液，用力摇动均匀，并在30℃水浴中准确培养2分钟，加入1ml10%H3PO4以钝化酶。过滤后，吸取1ml滤液，加入1ml1%淀粉溶液，用0.01N碘标准溶液滴定至蓝色。按同一操作处理的煮沸的土壤提取液作为对照（3）结果计算：M=（V–V对照）·7÷5