酪氨酸酶活性抑制实验方法

酪氨酸酶活性抑制实验方法一、试剂：酪氨酸酶、酪氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、阳性对照（熊果苷粉末）、样品、去离子水二、试剂配制：1、磷酸盐缓冲溶液（PH=6.8）：先分别配制0.2M的磷酸二氢钠和0.2M的磷酸氢二钠。0.2M磷酸二氢钠：称取71.6gNa2HPO4-12H2O，溶于1000ml去离子水；0.2M磷酸氢二钠：称取31.2gNaH2PO4-2H2O，溶于1000ml去离子水；取51ML磷酸二氢钠+49ML磷酸氢二钠即得0.2M、PH=6.8的磷酸缓冲液。2、L-酪氨酸溶液：称取L-酪氨酸25.6g，用磷酸缓冲液定容于50mL容量瓶中，即得L-酪氨酸溶液。3、酪氨酸酶溶液：将马铃薯洗净，于4℃预冷4h左右。去皮，切成约1.0cm3丁状，于-20℃冷冻过夜。称重，按1：1（W:V）的比例加入4℃预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，3层纱布过滤，滤液于4000r/min离心10min，上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液，4℃保存，2h内用完。4、受试液的配制：将原先所配5mg/ml的溶液用甲醇稀释到1mg/ml.。5、阳性对照：取熊果苷粉末0.01g，溶于10ml的甲醇溶液，即得1mg/ml的对照品溶液。三、实验方法：依下表所示向试管中依次加入磷酸盐缓冲溶液、样品溶液、酪氨酸溶液，于35℃水浴10分钟。然后加入酪氨酸酶液，混匀，再在35℃下孵育30min，迅速转移至比色皿中，在475nm处测定吸光值。组别试剂受试液组阴性对照组阳性对照组空白对照组123缓冲液（ML）1.01.51.03.54.03.5受试液（ML）0.5000.500酪氨酸（ML）2.52.52.5000熊果苷（ML）000.5000.535℃水浴10min酪氨酸酶（ML）1.01.01.01.01.01.0受试组用空白对照组1调零，阴性对照组用空白对照组2调零，阳性对照组用空白对照组3调零。受试组吸光值为A1，阴性对照组吸光值为A2，阳性对照组吸光值为A3。抑制率=1－[（A1－A2）/(A3－A2)]×100%=（A3－A1）/(A3－A2)×100%注：受试液组共四种样品