酶免疫测定技术

酶免疫测定技术郭先锋山西医科大学第二医院检验科一.免疫凝集试验二.免疫沉淀试验三.免疫电泳试验四.放射免疫试验五.荧光免疫试验六.酶免疫试验七.化学发光免疫试验八.固相膜免疫分析技术九.免疫组织化学技术十.流式细胞分析技术十一临床免疫检验的自动化十二生物芯片技术（免疫测定的集成化和微型化）免疫凝集试验•直接免疫凝集试验玻片法？试管法？•间接免疫凝集试验类型正向间接免疫凝集试验反向间接免疫凝集试验间接免疫凝集抑制试验协同免疫凝集试验常用的间接免疫血凝试验举例？颗粒免疫凝集试验胶乳颗粒凝集试验举例？明胶颗粒凝集试验举例？炭颗粒凝集试验举例？甲苯胺红颗粒凝集试验举例？直接凝集反应玻片法：ABO血型鉴定试管法：肥达试验颗粒性抗原抗体（凝集素）正向间接凝集反应如：类风湿因子的检测可溶性抗原载体颗粒抗体（凝集素）反向间接凝集反应抗体可溶性抗原载体颗粒免疫沉淀试验•液相免疫沉淀试验絮状免疫沉淀试验透射免疫比浊试验散射免疫比浊试验•凝胶内免疫沉淀试验免疫扩散试验（单扩，双扩）免疫电泳技术（对流免疫电泳，火箭免疫电泳，免疫区带电泳，免疫固定电泳）液相内沉淀反应絮状沉淀反应环状沉淀反应如法医学血迹鉴定++——抗血清抗原抗原抗体凝胶内沉淀反应免疫扩散技术免疫电泳技术单向扩散试验双向扩散试验火箭电泳对流电泳免疫电泳标记免疫技术标记免疫技术：将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物（常用标记物：放射性核素、荧光物质、酶、化学发光剂、胶体金等）进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定抗原抗体复合物中的标记物，这种免疫技术称标记免疫技术标记免疫技术的分类一、按测定用途分类：1、免疫组化技术2、免疫测定技术二、按标记物分类：1、酶免疫技术2、荧光免疫技术3、放射免疫技术4、发光免疫技术5、金免疫技术主要的免疫标记物类别标记物用途荧光素FITC、RB200、TRITC免疫组化镧系元素螯合物免疫分析测定放射性核素3H、14C、32P、57Gr免疫分析测定125I、131I酶HRP、AP免疫组化免疫分析测定化学发光物Luminol、lucigenin免疫分析测定金属颗粒胶体金、铁蛋白免疫组化免疫分析测定放射免疫技术酶免疫技术发光免疫技术三大经典标记技术酶免疫试验概述：1.将试剂抗原或试剂抗体用酶进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的酶，这种免疫技术，称为酶标记免疫技术。2.分类：酶免疫组化技术酶免疫测定技术均相法异相法固相酶免疫试验液相酶免疫试验均相法：不需分离复合物与游离标记物即可直接测定的方法。异相法需分离复合物与游离标记物后测定临床上最常用的固相酶免疫试验是ELISA和免疫印迹酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA的原理和类型一、基本要求：1.使Ag(或Ab)结合到某种固相载体（？）表面，并保持免疫活性。免疫吸附剂2.使Ag(或Ab)与某种酶结合，既保持免疫活性，又有酶的活性。酶结合物3.标本、酶标记物能按一定的次序与固相载体表面的Ag(或Ab)结合，加入酶的底物后能产生有色反应。底物二、必备试剂：1.固相的Ag或Ab----免疫吸附剂2.酶标记的Ab或Ag----结合物3.酶反应的底物-------底物三、方法类型：1.夹心法（双抗体或双抗原）2.间接法检测抗体3.竞争法测抗体或抗原4.捕获法测IgM抗体3.竞争法Ag※Ag※Ab+AbAg(标本)(定量)AgAbEE终止液标本酶标抗体底物显色显色固相固相标本酶标二抗底物1.夹心法2.间接法4捕获包被法测抗体•IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。特点一：灵敏性该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶。众所周知,酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml。特点二：特异性其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。ELISA的技术要点一、试剂制备㈠免疫吸附剂㈡酶标记抗原或抗体二、反应条件的选择㈠酶标二抗浓度选择㈡包被抗原浓度的选择三、操作标准化一、试剂制备：㈠免疫吸附剂1.固相载体⑴要求：①吸附力强②能保持Ag或Ab活性③不参与化学反应④孔间性能一致或十分接近⑵载体性能检查①载体材料：+、-结果差别大②ELISA板：10ug/LIgG包被,加酶标抗IgG，显色后，测20孔的OD，要求CV10%。⑶常用载体：材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等形状：小试管、小珠、微量反应板2.Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高3.免疫吸附剂(固相Ag或Ab)制备：⑴包被：将Ag或Ab固相化的过程包被缓冲液、包被方法⑵封闭：包被后再用1~5%小牛血清白蛋白再包被，以消除由于血清标本和酶结合物中的蛋白质部分地被吸附于固相载体表面而导致的非特异吸附的干扰。㈡酶结合物：1.酶的要求：①酶的活性要强，纯度高、催化转化率高。②专一性强。③性质稳定、来源丰富、标记后稳定。④判断和测量酶活性的方法简单易行、敏感、精确。⑤酶本身、辅助因子和底物对人无害。⑥酶的底物易于配制、保存。⑦酶及其底物应价廉易得。2.ELISA常用酶：HRP（辣根过氧化物酶）、ALP（碱性磷酸酯酶）、ß-半乳糖苷酶等3.酶的底物：HRP可溶性底物及呈色：邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm)四甲基联苯胺(TMB)：黄色(450nm)5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm)ALP可溶性底物及呈色：对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm)4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)：荧光ß-半乳糖苷酶：4-甲基伞基-ß-半乳糖苷：荧光4.酶结合物的制备：⑴戊二醛交联法⑵过碘酸盐氧化法酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺橘红色黄色棕色兰色492450449425碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色红色400500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光黄色360,450420二、反应条件的选择1.酶标二抗浓度：100ug/LIgG，加稀释的酶标二抗，取OD=0.8者。2.包被Ag或Ab浓度：棋盘滴定法3.温度、时间等三、操作标准化1加样2保温3洗涤4比色四、影响ELISA测定的因素：1试剂盒原材料因素2标本因素（内源性？、外源性？）3实验室环境因素？4实验操作因素试剂盒因素：A固相材料：孔间不均B抗原或抗体：纯化(天然但干扰多)、合成(多肽分子较小，常有空间位阻)和基因抗原(与片段的选择和制备水平有关)C酶结合物D色原底物：OPD:致Ca，不稳定(避光)TMB：水溶性差(商品：配好)E运输储存操作中的注意事项：1标本的收集和保存2试剂的准备3加样4温育5洗板6显色7比色8结果判断样品的收集和保存：1.溶血标本可增加非特异性显色(Hb作用于HRP的辅基)。2.细菌污染标本因菌体内源性酶而假“-”(破坏Ag或Ab)或假“+”(非特异蛋白)。3.反复冻融可使抗体效价下降而假“-”。4.陈旧标本可使IgG聚集，引起间接法本底增加。5.标本用NaN3防腐，可出现假“-”。试剂的准备：注意不同地区冬、夏温差，可造成达到37℃的时间差异，对弱阳性结果有很大影响。加样：总体积约360ul，包被和封闭均为100ul，未封闭部分可吸附非特异蛋白温育：14℃过夜最佳，37℃2h较好，43℃20min可造成弱“+”假“-”2水浴较温箱等空气浴均匀洗板：手洗效果最佳自动洗板要注意残留液量。显色对HRP，显色完全需30min,15min只达80%,易造成弱“+”假“-”比色：单波长比色需设空白孔：OD=OD样品-OD空白双波长比色不需设空白：OD=OD450nm-OD630nm结果判断：1注意夹心法假“-”2用cut-off(CO)值判断3“灰区”时建议动态观察4结合临床用药：例如抑制剂对HBsAgELISA出现的问题和解决办法•结果重复性差：•1.加样时间的长短,保温时间不一致;•2.洗涤条件不一致;•3.操作人员的变换;•实验条件要一致.•操作要标准化和一致性.ELISA出现的问题和解决办法•假阳性增多:（花板）•1.水箱温度偏高,酶反应时间延长;•2.洗涤不充分;•3.样品溶血;•4.检测样品放置时间过长,样品污染;•5.标本中存在干扰物质.如RF.•按说明书要求操作，注意样品的质量。ELISA出现的问题和解决办法•全部显深色：（均板）•底物试剂污染（检查未用之底物色泽）•洗涤不充分（延长洗涤时间，增加洗涤次数）酶结合物浓度过高•阳性对照不显色或颜色变浅：•1.试剂加样错误(检查操作过程重复试验)•2.检测波长不正确(以450nm滤光片检测）•3.加样误差较大(用精确加样器仔细加样)ELISA出现的问题和解决办法ELISA出现“一片白”的原因：（白板）⑴载体吸附性能差⑵底物错或误加终止液⑶稀释液当作包被液使用⑷加错试剂⑸包被时间过短⑹酶活力低或下降，试剂失效⑺样品含有NaN3。ELISA出现的问题和解决办法•孔间差大(双孔对照时)•1.加样器误差较大(误差值5%):•校准加样器，或更换加样器•2.洗涤不均匀或留有气泡:•洗涤时应将气泡用洗耳球吹去•3.试剂未混匀:混匀•4.酶标仪质量问题或预热不够:•选用高质量的仪器,预热充分,按仪器操作•手册操作.ELISA出现的问题和解决办法•5.试剂盒未平衡至室温:(平衡至室温)•6.温育温度不平衡:温育温度平衡,严格按•标准化操作条件进行.•阴性对照显色过深:•1.试剂污染;更换试剂•2.洗涤不充分:延长洗涤时间,增加洗涤次数•3.对照交叉污染:重复进行试验2019/12/16临床常用免疫学检查45临床常用免疫学检查免疫功能检查自身免疫检测感染免疫检测肿瘤标志物检测(tumormarker)器官与骨髓移植的检测病毒肝炎血清标志物其它如生殖免疫检测等等欢迎批评指正思考题•1.抗原抗体反应的影响因素（3点）•2.ELISA基本方法类型•3.临床免疫检验技术常用的标记物有哪几类•4.酶免疫试验常用的固相载体、酶和底物。•5.ELISA的基本原理•6.HIV感染的筛查试验和确认试验有哪些•7.梅毒特异性试验和非特异性试验有哪些•8.影响ELISA的操作因素有哪些