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醇溶性谷蛋白对大米淀粉和谷粉的结构成分和糊化成分的影响摘要介绍大米的经济效用受到其结构性与糊化性的强烈影响，例如硬度和粘度。这些有关特性的针对性的组合会对大米的最终用途产生重要作用。例如，像寿司这样的产品就需要软糯的米而印度菜通常需要大米有实而不粘的性质。除此之外，还有一些未知的因素影响着这些性质。至今，一些研究集中在淀粉功用成功的例子上。当然，Champagne说明了即使是有着相同淀粉成分和组成的作物可能有着截然不同的结构性和糊化性，这表明除了淀粉之外还有其它成分在这些特性上有影响。最近研究表明蛋白质在决定大米的这些性质中有一席之地。举例来说，Lim报告称降低大米谷粉中蛋白质的含量这一举动提升了其最高粘度。而提出蛋白质含量与谷粉中最高粘度和热团粘度呈负相关的Tan和Corke也证实了这一推断。作为补充，Lyon发现蛋白质含量与熟米的粘性呈负相关。这些研究都表明总蛋白含量与大米的物理性质有联系，可仍无法准确明晰单个蛋白质对大米这些性质的影响。一些基础研究已经表明谷氨酸和分子量60的淀粉合成蛋白酶与粘性和其它结构性质有关。可是对脯蛋白——大米胚乳中第二大基本成分——对大米物理性质的作用却知之甚少。这次探究的目的就是标题所说的那样。实验方法材料准备这次研究中用到三种大米（M103，Amaroo，Hitomebore），都是来自澳洲Nsw的Yaco农业管理局的2001至2002年的品种。水含量平均12%的米粒脱壳，碾磨60s。受损的谷粒通过称重法剔除。碾磨后的谷粒通过0.12mm的显示屏检视，谷物所含淀粉情况来自SigmaAldrichPtyLtd。谷粉脱脂谷粉样本在提取醇溶谷蛋白前进行脱脂以便于在商品谷物淀粉中添加醇溶谷蛋白的试验中的蛋白提取物中脂类的最小化。在脱脂操作中，先在谷粉样本中添加14体积的乙醚/甲醇（1:1;v/v）的混合物，匀浆混合均匀，静置1h。在10,000g下离心10min。重复三次，确保脱脂尽可能完全。醇溶谷蛋白提取前的预处理为了增强提取效果，试剂用几种不同的溶剂和溶剂/水混合物进行处理，包括：添加1%DTT的100%异丙醇，异丙醇（100%。50%），乙醇（100%，50%）。用3体积的溶剂提取谷粉中的醇溶谷蛋白。混合均匀，静置30min，混匀，以10，000g，15℃离心10min。整个提取过程重复四次，每次处理用到两种不同的谷粉样本作为对照。每次利用BioradDC蛋白质序列工具通过Lowry法提取后进行提取物中蛋白质的浓缩。分别利用溶剂中溶解的醇溶谷蛋白绘制标准曲线。醇溶谷蛋白的提取以上实验证实了100%异丙醇是提取的最佳溶剂。因此，之后的试验中就用2.3中列出的溶剂。提取物用去离子水在室温下渗析，隔夜放置。蛋白质的浓缩如2.3所述。为了确定提取物中蛋白质含量，上述处理后，冷冻干燥蛋白质提取物，称重，用LECOFp-2000分析仪测定总氮含量。RVA糊化分析糊化性通过Rapid-Visco粘度分析仪并遵照AACC认证的61-02（200）方法测定，改进后冷却时间延长至5min，并保持50℃5min，以确保最大粘度的数据被获取。分以下几种情况分别测定：淀粉，去谷粉淀粉，重构谷粉，和Sigma淀粉添加或不添加谷粉的情况。重构谷粉通过2.4中从最开始提取出醇溶谷蛋白的残余谷粉中获得。醇溶谷蛋白提取物用去离子水渗析，隔夜放置，与谷粉提取残留物混合，40℃干燥称重。每次RVA分析物含3g谷粉或淀粉，家去离子水至28ml。分别测定并记录最大粘度，热团粘度，最终粘度，结构分解粘度（由最大粘度到热团粘度），重构粘度（最终粘度到最大粘度）。每次平行测定两组。吸水衡量通过Konik-Rose方法测量加热过程中谷粉的水吸收数据。精确称量100mg谷粉，加入1.5ml的离心管中，加1ml水或含3g醇溶谷氨酸的提取物，加热至95℃.在18min的加热过程中每隔3min移动样品，冷却至室温，在10,000g下离心10min，用两体积的异丙醇重悬以去除非结合水。淀粉-异丙醇混合物在10,000g离心10min，吸取上清液，对残余物称重。每个数据平行测三次。组织性分析RVA分析后形成的谷粉凝胶的组织成分通过TAXT2结构分析仪测定。凝胶用石蜡纸密封在试管中，以阻止水分流失，在4℃下隔夜放置放置，允许部分溶解。分析要用到标准双循环程序（TPA方法）10-mm橡胶探针以2mm/s的速度下移48mm。在获取的含量-时间曲线中，硬度（循环1中的含量高峰），粘连度（两次循环中正含量面积的比值），粘度（第一次循环负含量的比值），焦黏度（硬度乘粘连度），通过设备上的TextureExpert程序计算获得。数据分析获取的数据通过WindowsTM上的SPSS进行独立样本t检验或者ANOVA检验。对于添加醇溶谷氨酸的实验组，样本对照通过ANOVA检测进行，方差不高于5%；对于醇溶谷氨酸剔除的实验组，平行对照用t检验法分别检验三种作物的谷粉和去谷粉蛋白提取物，方差不超过1%或5%。实验结果提取醇溶谷蛋白的流程优化测试不同的蛋白提取介质对优化醇溶谷蛋白提取结果优化的影响（图表1）。结果表明异丙醇在不同浓度（100%，50%）都优于乙醇，并且异丙醇（100%）优于异丙醇（50%）。而加入DTT的异丙醇并没有明显提升提取效果，反而有些许降低提取率。基于以上结果，在随后试验中使用未添加DTT的100%异丙醇作为提取介质。另外，在经过三次提取后，醇溶谷蛋白已基本完全提取。醇溶谷蛋白提取的有效性和纯度为了确定本次试验中从三中不同大米样本中提取的醇溶谷蛋白的纯度，需测定提取物中的固体总量和蛋白质总量。从10g作物Hitomebore，M103，和Amaroo的粉状样本中的平均固体质量分别为0.143，,0139和0.148g。而蛋白质含量为95.4,94.8和95.7%。在大米淀粉的结构和糊化成分中加入醇溶谷蛋白的影响在每3g大米淀粉中加入100mg醇溶谷蛋白对RVA糊化性质有明显(P001)作用(表1）.从不同大米中提取醇溶谷蛋白加入大米淀粉引起了RVA分解粘度值的上升（P0.05）和重构粘度值的下降（P0.05）。同时观察到加入醇溶谷蛋白后最大粘度值总体上呈下降趋势，只有从Amaroo中提取的蛋白具有明显作用。同时得到不同含量的蛋白对RVA分解粘度值得影响（图2）。当每g大米淀粉中的蛋白含量为0至45mg时，样本呈正线性相关。当含量高于45mg/g，分解粘度值没有明显增加。（图2A）。为了探明在大米凝胶中醇溶谷蛋白的影响，对经过RVA分析后在罐中形成的样本凝胶进行TPA分析。对于所有不同样本，醇溶谷蛋白的加入明显软化了凝胶，并降低了粘合性和黏性（表2）。另外，在大米淀粉中提高醇溶谷蛋白的含量，会引起淀粉凝胶硬度（r2=0.99）和粘合性（r2=0.93）的线性下降（图2B，图2C）。在大米粉状样本中除去醇溶谷蛋白对其糊化性质和结构性质的影响对所有检测的样本，在其中除去醇溶谷蛋白都引起了分解粘度的明显下降（P0.01）（表3）和来自HItomebore，M103的样本的最大粘度的降低（P0.05）。同时，提高了大米粉状凝胶粘合性和粘性（P0.05）（表4）。为了确定醇溶谷蛋白的提取和重构构成是否改变了大米的糊化性质，将重组大米粉的RVA粘度与原始大米的RVA粘度曲线对比（图3）。结果显示重组大米粉的粘度曲线与原始大米粉的粘度曲线基本重合。添加醇溶谷蛋白对大米淀粉吸水性的影响在加热过程中大米淀粉吸水量每3min测量一次，持续18min（图4）。在加热早期阶段，加入醇溶谷蛋白的大米淀粉在吸水速率上明显快于单纯大米淀粉。在含醇溶谷蛋白样本中，结合水量在3min后明显下降而吸水量无明显变化。作为对照，单纯大米淀粉样本吸水更慢但有更高的最大吸水量，讨论现阶段研究表明醇溶谷蛋白对米团的分解粘度和大米粉凝胶的硬度，粘合性和粘性有明显影响。这是阐述醇溶谷蛋白对大米结构性质和糊化性质的影响的首次研究。（后面的都是作者的自我陶醉，我只翻译重点）。发现我们从大米粉样本中提取醇溶谷蛋白的流程能够提取出足够纯的蛋白来显示大米淀粉的糊化性质和结构性质的变化（表1,2），可确定这是蛋白质而不是脂质或淀粉的作用。蛋白的提纯过程不明显改变样本的RVA数据（图3），表明异丙醇不明显改变醇溶谷蛋白和其他大米成分的性质，由此可以推断试验中所观察到的那些糊化性质结构性质之类的鬼东西的变化确确实实是由醇溶谷蛋白引起的（表3）。由于加蛋白大米粉样本和纯大米粉样本相比，前者是由淀粉，谷蛋白和其它大米成分组成的更复杂的系统，所以两者的数据不相同这点事不足为奇。如谷蛋白，可能在一定程度上补偿了除去醇溶谷蛋白的影响。被广为接受的是，加热过程中淀粉粘度的增加主要由于淀粉颗粒的膨胀（蛋白质氢键断裂，直链淀粉构象改变）而粘度的突然下降是由于膨胀颗粒的裂解。看上去就像是在加入醇溶谷蛋白后，提高了淀粉颗粒在RVA过程中裂解的几率。这可能由于当存在醇溶谷蛋白时，淀粉颗粒吸水量的增加（图4）此外，加热3min后吸水量的大幅降低，表明加热过程中大部分淀粉颗粒已裂解，因此支持了上面的假说。