逆境胁迫对植物生理生化指标的影响1

1.1供应材料。小麦种子；主要试剂：0.1%HgCl2，TTC，3%磺基水杨酸（SSA），冰乙酸，茚三酮，PBS(pH=7.8)，0.6%TBA（用0.6%TCA配制），PBS(pH=6.8，内含1mMHA)，0.1%Ti(SO4)2[用20%(v/v)H2SO4配制]，PBS,（pH=5.8,内含0.１mmol/LEDTA,1%PVP），POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解），PPO反应混合液（20mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）5%三氯乙酸，PBS(pH=7.7)，4mMDTNB(用0.1MpH=6.8PBS现配)。主要仪器：分光光度仪，离心机，试管，微量加样器，研钵等。1.21Pro脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可和蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用，而且即使在含水量很低的细胞内，脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下，植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受干旱等胁迫时体内的脯氨酸含量明显增加，它在一定程度上反映植物受环境干旱胁迫的情况，以及植物对水分和盐分胁迫的忍耐及抵抗能力。1.22MDA植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，从膜上产生的位置释放出后，与蛋白质、核酸起反应修饰其特征；使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害，它在一定程度上也反映了植物受环境干旱胁迫的情况。1.23抗氧化酶植物体内存在着一套负责清除活性氧所产生的抗氧化系统，在植物正常生长情况下，它使活性氧的产生和清除处于动态平衡状态，在逆境诸如干旱胁迫下，这种平衡被打破。这种变化可通过分光光度器测定。1.24GSH还原型的GSH是植物细胞中重要的抗氧化剂之一，其可通过膜蛋白巯基与二硫键化合物结合的比例，对细胞膜起保护作用。其含量的变化，一定程度上反映了植物受干旱胁迫的情况。1.25H2O2过氧化氢是植物代谢中产生的一种产物，其积累对细胞具有氧化破坏作用，在实验中，可根据其值的变化，来了解组织的破坏程度。因此，过氧化氢的含量也是植物逆境的一项指标。1.3实验方法1.31Pro的提取。分别取0.1g实验组（为干旱处理5天）和对照组（不做干旱处理）的胚芽鞘置于研钵中，加入3mL3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂充分研磨，再用2mL3%SSA洗研钵，置于离心机中，在5000rpm下离心10min，取上清液，定容至5mL。测定：取上清液各2mL，分别加入2mL冰乙酸和2mL茚三酮试剂再煮沸15min，冷却后，5000rpm离心10min，分别测定A520。1.32MDA提取。分别取0.1g实验组和对照组（与1.32做相同处理）置于研钵中，加入3mL50mMPBS(pH=7.8)和少许石英砂充分研磨，再用2mLPBS洗研钵，置与离心机中，在5000rpm下离心10min，取上清液，定容至5mL。测定：分别取上清液各2mL，加入0.6%TBA（用0.6%TCA配制）2mL，煮沸12min，冷却后，5000rpm离心10min，分别测定OD450和OD532。1.33抗氧化酶的提取。分别取0.1g实验组和对照组（同1.32做相同处理）置于研钵中，加入3mL50mMPBS(pH=6.8，内含1mMHA)和少许石英砂，充分研磨，再用2mLPBS洗研钵，置于离心机中，在5000rpm下离心10min，取上清液，定容至5mL。测定：POD测定；取POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解）3.00ml，加入酶液（提取液）100ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应3min时的A470。PPO测定：取PPO反应混合液（20mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.8ml，加入酶液（提取液）0.2ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应2min时的A410。1.34GSH的提取。分别取0.1g实验组和对照组的胚芽鞘（同1.32做相同处理）置于研钵中，加入3mL5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂，充分研磨，用2mL5%TCA洗研钵置于离心机中，在5000rpm下离心10min，取上清液定容至5mL。测定：上清液各1mL，分别加入1mL0.1MPBS(pH=7.7)和0.5mL4mMDTNB(用0.1MpH6.8PBS现配，空白用此PBS代替)，25℃5min，分别测定A412。1.35H2O2提取。分别取0.1g实验组和对照组，加入3mL50mMPBS(pH=6.8，内含1mMHA)和少许石英砂充分研磨，用2mLPBS洗研钵，5000rpm离心10min，上清液定容至5mL。测定：分别取上清液各3mL→加入0.1%Ti(SO4)2[用20%(v/v)H2SO4配制]1mL，摇匀→。5000rpm离心10min，OD410。2结果与分析2.1Pro表一Pro正常组和实验组的A520和Procontent正常干旱胁迫A520=0.117Procontent=5.42(mol.g-1FW)A520=2.935Procontent=135.88(mol.g-1FW)由上表可知，干旱胁迫下，脯氨酸的量是正常值的25倍，由此可以得到，干旱胁迫会造成脯氨酸的积累。但是，植物合成、累积及代谢是一个受非生物胁迫的一个过程，因此，脯氨酸的积累可能是生物受胁迫的一个信号。当植物处于干旱条件下时，为了保护植物对干旱逆境的反应，在干旱胁迫下，脯氨酸的质量分数会急剧上升。而脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，这表明它具有易于水合的趋势或具有较强的水合能力。它的增加可能是植物对干旱胁迫的一种保护性反应。2.2MDA表二正常组和实验组的A450、A532和可溶性糖及MDA的浓度。正常干旱胁迫A450=0.075A450=1.475A532=0.047A532=0.418可溶性糖浓度=0.88mmol/L可溶性糖浓度=17.27mmol/LMDA浓度=0.26umol/LMDA浓度=1.87umol/L以上实验结果是通过以下方程处理而得。用总显VVVWLA520以上通过Procontent=(mol.g-1FW)而处理得由上表可知，干旱胁迫下，丙二醛的浓度是正常情况下得7倍，因此，在干旱胁迫也会造成MDA的积累，MDA的最大特点是对细胞质膜和细胞中的许多物质均有很强的破坏作用，因此，植物组织可能是通过产生并积累MDA等对细胞有害物质，进而破坏植物组织，使植物在逆境坏境中生长不好。2.3抗氧化酶表三正常组和实验PPO和POD不同时间所测得值PPO和PODactivities正常干旱胁迫PPOA410=0.114（30s）A410=0.116（1min30s）A410=0.118（2min）PPOA410=0.07（30s）A410=0.073（1min30s）A410=0.075PODA410=（30s）A470=1.419（1min）PODA410=0.385（30s）A410=0.783（1min）PPOactivities=50(U.g-1FW)PPOactivities=75(U.g-1FW)PODactivities=(mol.g-1FWmin-1)PODactivities=44.89(mol.g-1FWmin-1)以上数据是通过以下方程计算而得由上表可知，在干旱胁迫下，也会造成PPO和POD的积累。抗氧化酶的主要作用是消除ROS对植物的伤害，使抗氧化酶与ROS处于一个动态平衡。在干旱胁迫下，抗氧化酶总体增加，说明，这一个动态平衡体系被打破，使植物不能消除ROS对自身的伤害，因而，逆境下植物生长不好。2.4GSH表四正常组和实验组GSH的A412值和GSHcontent正常干旱胁迫A412=0.071A412=0.166GSHcontent=0.91(mol.g-1FW)GSHcontent=2.14(mol.g-1FW)GSHcontent是通过以下公式计算而得用总显VVVtWA470PODactivities=(mol.g-1FWmin-1)用总VVtWA01.0410PPOactivities=(U.g-1FW)由上表可知，逆境中，GSH含量也明显增加，，在干旱胁迫下也一定程度上造成了GSH的积累。GSH是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，如与自由基、重金属等结合，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质。GSH含量的增加，一定程度上，反应了植物在逆境中，也能合成一些产物，增加其抗逆性，以便植物能在逆境中生长。2.5H2O2表五正常组和实验组H2O2的A410和H2O2content正常干旱胁迫A410=0.087A410=0.532H2O2content=20.71(mol.g-1FW)H2O2content=126.67(mol.g-1FW)以上H2O2content是通过以下公式计算而得：由上表可知，干旱胁迫下，也会造成过氧化氢的积累。过氧化氢是体内重要的代谢产物，其积累对细胞具有氧化破坏作用，其含量的高低，一定程度上反映了CAT活性的高低。因此，在干旱胁迫下，有可能是CAT酶活性降低，造成过氧化氢在植物体内的积累，从而破坏了细胞的氧化作用，使植物不利于在逆境中生长。用总显VVVWLA412GSHcontent=(mol.g-1FW)用总显VVVWLA410H2O2content=(mol.g-1FW)