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山东省昌乐及第中学高二生物学案NO.2编制：高伟强审核：王京礼审批：时间：2013.3.11专题11.2基因工程的基本操作程序课前预习案一、预习目标简述基因工程原理及基本操作程序。二、预习内容1.基因工程的基本操作程序主要包括哪四个步骤？2.目的基因主要是指什么，也可以是什么？目前常用的获取目的基因的方法有哪三种？3.什么是基因文库？有哪几种？如何区分？4.从基因文库中获取目的基因的依据有哪些？（找出5条）5.利用PCR技术扩增目的基因：（1）PCR的含义：一项在生物体外_____特定DNA片段的核酸合成技术。其原理是。（2）前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_________。（3）过程：目的基因DNA受热变性后解链为，与相应互补序列结合，然后在作用下进行延伸，形成DNA。（4）方式：成______形式扩增（约为_____，其中n为扩增循环的次数）。6.人工合成法：当基因较，核苷酸序列时，可以通过DNA合成仪用化学方法直接合成。7.基因工程的核心是什么？目的是什么？8.一个基因表达载体由什么组成？各有什么功能（作用）？9.什么是转化？10.将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是什么?除此之外，还有什么方法？11.转基因动物中采用最多，最为有效的将目的基因导入动物细胞的方法是什么？12.大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用___处理细胞，使细胞处于一种_________________的生理状态，这种细胞称为__________。第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与细胞混合，在一定的温度下促进细胞吸收DNA分子，完成转化过程。13.目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是什么？检测方法是什么？态度决定一切214.检测目的基因是否发挥功能作用的第一步是什么？检测方法是什么？15.检测目的基因是否翻译成蛋白质的方法是什么？除了上述分子检测外，有时还需要进行什么水平的鉴定？三、预习自测1.下列有关基因工程操作顺序的组合中，正确的一组是（）①目的基因的检测与表达②目的基因与运载体结合③将目的基因导入受体细胞④目的基因的提取A、①②③④B、④③②①C、④②③①D、③④②①2.下列有关基因工程技术的叙述，正确的是()A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和基因进入受体细胞的载体B．所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列C．选用细菌作为重组质粒的受体细胞主要是因为细菌繁殖快、遗传物质少D．只要目的基因进入受体细胞就能成功实现表达3.下列属于获取目的基因的方法的是()①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术⑤利用DNA转录⑥人工合成A．①②③⑤B．①②⑤⑥C．①②③④D．①②④⑥四、提出疑惑同学们，通过你的自主学习，你还有哪些疑惑？课内探究案一、学习目标及重难点：1、简述基因工程原理及基本操作程序。2、尝试设计某一转基因生物的研制过程。学习重点：基因工程基本操作程序的四个步骤。学习难点：（1）从基因文库中获取目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因。二、学习过程（一）目的基因的获取1.PCR技术与DNA复制有何异同比较项目DNA复制PCR技术不同点场所酶引物温度相同点2.如何区分不同的基因文库？（见课本第10页表格）（二）基因表达载体的构建1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？2.基因表达载体的构建需要哪些工具酶？山东省昌乐及第中学高二生物学案NO.2编制：高伟强审核：王京礼审批：时间：2013.3.133.将目的基因与运载体混合并用DNA连接酶处理后，会出现几种结果？（三）将目的基因导入受体细胞1.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，你应该如何做？2.比较将目的基因导入受体细胞的方法生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法受体细胞转化过程（四）目的基因的检测与鉴定1.为什么要有“目的基因检测与鉴定”这一步？2.分子检测过程中，有哪几种杂交带？各说明什么问题？三、反思总结基因工程的基本操作步骤主要方法、技术或组成步骤一：步骤二：步骤三：导入植物细胞：导入动物细胞：导入微生物细胞：步骤四：β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？四、当堂检测1.下列关于基因工程的叙述，正确的是（）A.基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因B.细菌质粒是基因工程常用的运载体C.通常用一种限制性核酸内切酶处理含目的基因的DNA，用另一种处理运载体DNAD.为培育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为载体态度决定一切42.PCR技术扩增DNA，需要的条件是（）①目的基因②四种脱氧核苷酸③DNA聚合酶等④mRNA⑤核糖体⑥RNA引物A．①②③⑥B．②③④⑥C．①②③D．①②⑤⑥3.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在其基本操作步骤中，不进行碱基互补配对步骤是A．人工合成基因B．目的基因与运载体结合C．将目的基因导入受体细胞D．目的基因的检测和表达4.目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是（）①检测受体细胞是否有目的基因②检测受体细胞是否有致病基因③检测目的基因是否转录mRNA④检测目的基因是否翻译蛋白质A.①②③B.②③④C.①③④D.①②④5.人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体加工合成。通过转基因技术，可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是（）A．大肠杆菌B．酵母菌C．T4噬菌体D．质粒DNA课后练习与提高1.应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是指（）A.人工合成的免疫球蛋白的DNA分子B.用放射性同位素或荧光分子等标记的蛋白质分子C.人工合成的苯丙氨酸羟化酶的DNA分子D.用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子2.下列获取目的基因的方法中需要模板链的是()①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④D．②③3.下图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作答。（1）能否利用人的皮肤细胞来完成①过程？为什么？。（2）过程②必需的酶是酶，过程③必需的酶是酶。（3）若A中共有a个碱基对，其中鸟嘌呤有b个，则③④⑤过程连续进行4次，至少需要提供胸腺嘧啶个。（4）在利用AB获得C的过程中，必须用切割A和B，使它们产生，再加入，才可形成C。（5）为使过程⑧更易进行，可用（药剂）处理D。(6)上述过程中涉及的现代生物技术有。(7)在利用大肠杆菌生产人胰岛素过程中，目的基因是，所用载体是。表达载体的结构组成包括____________、____________、____________、____________。(8)目的基因在大肠杆菌中表达时，必须经过和过程。人胰岛细胞大肠杆菌胰岛素mRNAA①人胰岛素人胰岛素大量的A重复进行③④②⑤⑥⑦⑧⑨⑩BCD山东省昌乐及第中学高二生物学案NO.2编制：高伟强审核：王京礼审批：时间：2013.3.15专题11.2基因工程的基本操作程序【课前预习学案参考答案】1.目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定2.编码蛋白质的基因一些具有调控作用的因子从基因文库中获取目的基因；利用PCR技术扩增目的基因；通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。3.基因文库是指将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。有基因组文库、部分基因文库两种。区别见课本第10页表格。4.基因的核苷酸序列；基因的功能；基因在染色体上的位置；基因的转录产物mRNA；基因的表达产物蛋白质。5.（1）复制DNA复制（2）引物（3）单链引物单链DNA聚合酶（4）指数2n6.小已知人工7.基因表达载体的构建使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给后代；使目的基因能够表达和发挥作用。8.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因（如抗生素基因）①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端,能使转录在所需要的地方停下来。③标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。9.目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程10.农杆菌转化法基因枪法、花粉管通道法11.显微注射技术12.Ca2+能吸收周围环境中DNA分子感受态感受态13.检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因DNA分子杂交14.检测目的基因是否转录出了mRNA分子杂交技术15.抗原-抗体杂交个体生物学水平三、预习自测1.C2.C3.D【课内探究案参考答案】（一）目的基因的获取1.PCR技术与DNA复制有何异同？比较项目DNA复制PCR技术不同点场所生物体内生物体外酶解旋酶、DNA聚合酶DNA聚合酶引物RNA引物RNA引物温度常温55～95℃相同点原理相同（二）基因表达载体的构建1.不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。态度决定一切62.限制酶、DNA连接酶3.目的基因-运载体连接、运载体-运载体连接、目的基因-目的基因（三）将目的基因导入受体细胞1根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。2.比较将目的基因导入受体细胞的方法：生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2＋处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T—DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子（四）目的基因的检测与鉴定1.目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性。2.见答案最后的附加。基本操作如下：（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。五、