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一、基因工程：基因工程的基本原理与技术（Ⅰ）1．基因工程概念：是在DNA分子水平上进行的，又叫做DNA重组技术。原理：基因重组。2．3种工具：2种工具酶和载体（1）工具酶：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、都作用于DNA双链的磷酸二酯键。（2）载体：包括质粒、动植物病毒等，最常用的是质粒。它是一种裸露的、结构简单，独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。3．基本操作程序（四步如下）：（1）目的基因的获取：序列已知：通过化学方法合成如胰岛素基因、利用PCR技术扩增目的基因；序列未知：从基因文库中获取目的基因；PCR技术扩增目的基因：①条件：模板（目的基因）、原料（4种脱氧核苷酸）、酶（热稳定DNA聚合酶）、引物2种②原理：DNA双链复制③过程：变性、复性、延伸。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心，标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。（3）将目的基因导入受体细胞导入植物细胞的方法：采用最多方法是农杆菌转化法导入动物细胞的方法：显微注射法，受体细胞为动物的受精卵。导入微生物细胞的方法：先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子。（4）目的基因的检测与鉴定①分子水平：分子杂交均以含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，作为探针。②个体水平：需要做抗虫或抗病的实验；注：基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。二、克隆技术：（一）克隆的定义和理论基础1、定义：是指无性繁殖，2、举例理论基础分子水平的克隆：如PCR扩增DNA——DNA双链复制细胞水平的克隆：如动物细胞培养——细胞的增殖个体水平的克隆：如克隆动物、——细胞核的全能性植物的微型繁殖——细胞的全能性（二）植物细胞工程1、植物细胞工程包括的技术有植物组织培养、植物体细胞杂交2、植物组织培养的原理：即理论基础：植物细胞的全能性（1）细胞全能性：具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。（2）全能性原因：生物体细胞含有本物种特有生物全套遗传物质（遗传信息）。（3）分化的实质是基因在特定的时间和空间选择性表达。3.植物组织培养过程：离体的植物器官、组织或细胞→愈伤组织→丛芽―→生根→植物体（胚状体）（2）愈伤组织（3）条件：无菌、离体、适宜的温度与pH、营养物质、植物激素。（4）培育转基因植物、植物体细胞杂交育种、单倍体育种都需要植物组织培养技术。4、植物体细胞杂交：（1）概念：将不同种植物的体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。（2）过程：包括原生质体融合+植物组织培养两个过程）脱分化再分化（3）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。去壁：纤维素酶和果胶酶（4）意义：克服不同生物远缘杂交的障碍。（三）动物细胞工程:包括的技术有动物细胞培养（基础）、动物细胞融合、动物细胞核移植、生产单克隆抗体。1、动物细胞培养（1）流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。注意：接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。随细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。（2）培养的条件：无菌、无毒；营养（葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、血清、血浆）；适宜温度和PH；气体环境（二氧化碳培养箱，CO2的主要作用维持培养液的PH）2、动物体细胞核移植技术和克隆动物（1）概念：动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。（2）选用去核卵(母)细胞的原因：其细胞质中存在激发细胞核全能性表达的物质；细胞比较大，容易操作；细胞质多，营养丰富；。3、动物细胞融合：和植物原生质体融合不同的方法是灭活的病毒；其它原理方法与植物相同。4、单克隆抗体（1）注意两次筛选：1是选择培养基筛选出杂交瘤细胞；2是转移抗体检验成阳性选出产生单克隆抗体的的杂交瘤细胞。（2）杂交瘤细胞：骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合形成的杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能产生专一的抗体。（3）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。（4）单克隆抗体的应用：用于治疗疾病和运载药物：主要用于癌症治疗，可制成“生物导弹”——单克隆抗体+放射性同位素、化学药物或细胞毒素相结合），借助单克隆抗体的导向作用。四、生态工程的原理1、物质循环再生原理、2、物种多样性原理、3、协调与平衡原理、4、整体性原理、5、系统学和工程学原理微生物的培养与应用一．微生物的分离和培养1.培养基：(1)成分：一般是碳源、氮源、水和无机盐如牛肉膏、蛋白胨培养基：牛肉膏主要提供碳源（其次有无机盐和维生素）蛋白胨主要提供氮源（其次有维生素）（2）种类选择培养基培养基中加入某种物质，允许特定种类微生物生长，抑制或阻止其他种类微生物生长分离出特定的微生物以尿素作唯一氮源可以分离分解尿素的细菌鉴别培养基根据微生物的特点，加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物刚果红可以鉴别纤维素分解菌；伊红-美蓝鉴别大肠杆菌，菌落呈黑色（深紫色，并带有金属光泽）。（3）制备过程计算称量溶化灭菌倒平板注意倒平板的操作技术：冷却50度左右倒，酒精灯火焰旁，冷凝后倒置。2.无菌技术（1）消毒:较温和的物理或化学方法杀死体表或内部一部分有害微生物（不包括芽孢和孢子）方法：煮沸消毒法：巴氏消毒法：如鲜奶化学药物消毒法：70%酒精擦手紫外线消毒法:操作空间（2）灭菌：强烈的理化因素杀死体内外所有微生物，包括芽孢和孢子方法：灼烧灭菌：接种环、试管口、涂布器等用具干热灭菌：耐高温、需干燥的物品如玻璃器皿。高压蒸汽灭菌：适用广泛如培养基、无菌水3、微生物接种的方法：两种平板划线法：操作简单，但是单菌落不易分离稀释涂布平板法：操作复杂，包括系列稀释操作和涂布平板操作两步。注意：（1）平板划线操作的三次灭菌第一次灼烧第二次灼烧第三次灼烧目的避免接种环上可能存在的微生物污染培养物杀死上次划线结束时接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种均来自上次划线的末端杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者（2）微生物分离的原理平板划线法原理：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐渐稀释分散到培养基的表面，在数次划线后的培养，可以分离得到由一个细胞繁殖而来肉眼可见的子细胞群体，即形成单个菌落。稀释涂布平板法原理：将菌液进行一系列的的浓度稀释后（10倍系列稀释），将不同稀释度的菌液涂布到固体培养基的表面，当稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分离成单个细胞，从而在培养基上形成单个菌落。二、测定某种微生物数量（统计菌落数目的方法：两种）1、显微镜直接计数法原理：利用特定的细菌计数板活血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量缺点：不能区分死菌和活菌2、活菌计数法原理：样品稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的的一个活菌。通过统计菌落数，推测样品中大概含有多少活菌。接种方法：稀释涂布平板法计数：一般选择菌落数在30～300的平板进行计数计算公式：每克样品中的菌落数=（C÷V）×M字母含义：C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用稀释液的体积；M：稀释倍数注意：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。三、简述微生物的利用1、分解尿素的细菌鉴定原理现象：在尿素作为唯一氮源的培养基种加入酚红指示剂，指示剂变红。原因：利用尿素的微生物合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基碱性增强，pH升高，于是培养基中的酚红由黄色变为红色。2、分解纤维素的微生物的分离原理：利用纤维素为主要碳源的选择培养基分离出分解纤维素的微生物。现象：刚果红染色法，通过是否产生透明全来筛选纤维素分解菌原因：分解纤维素的微生物中有纤维素酶四、利用微生物发酵来生产特定的产物酵母菌醋酸菌毛霉乳酸菌生物学分类真核生物原核生物真核生物原核生物代谢类型异养兼性厌氧异养需氧异养需氧异养厌氧生产应用酿酒酿醋制作腐乳制作泡菜发酵条件前期需氧，后期不需氧一直需氧一直需氧无氧