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基因工程•基本工具•工具酶•限制(性核酸内切)酶•[限制酶切割位点]•使用[同一种限制酶]切割[质粒]和[含有{目的基因}的DNA]•DNA连接酶•用[DNA连接酶]处理，形成重组载体•酶切产物用[DNA连接酶]连接后，两个DNA片段连接结果有[3]种(目的基因＋目的基因，目的基因＋质粒，质粒＋质粒)•载体(重组载体)：质粒或病毒•用DNA连接酶将切割产物连接，构成[重组质粒(重组DNA)]并将其导入到受体菌种•载体一般选用[质粒]、[病毒]，质粒的形状成[环状]•常用作基因工程载体的是[质粒(或病毒)]•基因工程中的载体化学本质是[DNA]；细胞膜载体化学本质是的[蛋白质]•兼容性•★人的基因与大肠杆菌的DNA分子进行重组，原因是[DNA的结构相同]not统一性•★人体的生长激素基因能在细菌提内成功表达是因为[共用一套(遗传)密码子]•基因的表达与复制•基因的表达•真核生物与原核生物的基因结构有所不同，其原因是[编码区是间断的不连续的]•若将真核基因在原核细胞中表达，对该目的基因的基本要求是[不含有内含子片段]•基因的复制，PCR技术•PCR遵循的原则是[碱基互补配对原则•原料技术过程原料酶PCRDNA复制模板DNA引物4种游离的脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶cDNA构建RNA反转录成DNA模板RNA4种游离的脱氧核苷酸逆转录酶•★PCR扩增需在一定的缓冲液中进行，反应体系中应加入模板、引物、[4种游离的脱氧核苷酸]作为原料，以及[耐高温的DNA聚合]酶•★PCR与生成cDNA时所加反应物不同的是模板cDNA、引物、[耐高温的DNA聚合]酶•高温解旋•★通过控制[温度]条件使DNA复制在体外反复进行not温度和pH•其他条件•★PCR技术的必须条件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少需要三个条件，即[液体环境]、[适宜的温度]和[酸碱度]其他相关技术•植物组织培养相关†•科研人员常用[植物组织培养]方法保持转基因的优良性状•将转入的抗盐基因的烟草细胞培养城完整的植株需要用[植物组织培养]技术•目的基因导入棉花首体细胞后，培育成抗虫棉的过程所采用的技术是[植物组织培养]•将转入抗盐基因的烟草细胞培育成完整的植株需要用[植物组织培养技术]•育种相关§•与诱变育种比较，基因工程方法的明显优势是[基因工程产生的变异是定向的]•由于玉米赖氨酸较少，科学家采用了[基因工程]技术，将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导入玉米体内•基因工程应用：蛋白质工程•蛋白质工程的目标是根据对蛋白质[功能]的特定需求，对蛋白质进行分子设计，根据中心法则便可以改造天然蛋白质•★所获得的产品是[人类需要的蛋白质(或自然界不存在的蛋白质)]•★蛋白质工程中直接操作的对象是[基因结构(或基因)]基本步骤•第一步：获取目的基因要获得目的基因，可采用[从基因文库提取]：[基因组文库]、[cDNA文库(反转录)][PCR扩增][人工合成]等方法•cDNA文库，反转录•★若已获取目的基因的mRNA，可通过[反转录]获取目的基因not人工合成•cDNA文库的构建过程是[反转录]•第二步：基因表达载体的构建•启动子•[启动子]位于基因的首端•是[RNA聚合酶]识别和结合部位•为确保基因转录，结构A上应具有[RNA聚合酶]结合位点•终止子•[终止子]位于基因的尾端•目的基因•标记基因•其作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来在检测受体细胞中是否已经导入目的基因时，常常要借助载体上的[标记基因]的表达•第三步：将目的基因导入受体细胞•转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程•将目的基因导入受体细胞的方法基因工程中常用的受体细胞有植物细胞、动物细胞、微生物细胞•植物细胞：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法•抗虫棉培育，目的基因导入棉花受体细胞采用最多的方法是[农杆菌转化法]•动物细胞(受精卵)：显微注射法•将载体导入受精卵常用的方法是[显微注射法]•动物受体细胞使用受精卵，原因是[卵细胞较大、全能性较高]•微生物细胞(原核生物、大肠杆菌)：Ca2+处理成为感受态细胞，吸收DNA分子•导入受体细胞的方法－原因分析•动物受体细胞使用受精卵，原因是[卵细胞较大、全能性较高]•目的基因导入叶绿体DNA中可以避免“基因污染”，原因是：[叶绿体遗传表现为母系遗传，目的基因不会通过花粉传递在下一代中显现出来]•增殖•重组质粒转化到大肠杆菌的目的是[大量复制目的基因]•筛选•重组DNA分子成功导入受体细胞的频率[低]，所以在转化后通常需要进行[筛选]操作•为筛选出导入了重组质粒的农杆菌，应在培养基中加入[{某抗生素}]•第四步：目的基因的检测和表达•分子检测•是否插入基因组DNA：[DNA分子杂交技术](同位素标记基因探针、杂交带)•通常采用[DNA杂交]技术检测目的基因是否插入了小鼠的基因组•同时还要用基因探针与目的基因杂交，以检测[目的基因是否成功导入]•是否转录：[分子杂交技术](mRNA、同位素标记基因探针、杂交带)•是否翻译：[抗原-抗体杂交技术](蛋白质，相应的抗体，杂交带)•DNA、mRNA探针原理：[碱基互补配对原则]•个体生物学水平鉴定：•将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导入玉米体内，在玉米植株内成功表达的标志是[合成富含赖氨酸的蛋白质多]现代生物科技专题－细胞工程克隆的定义和理论基础定义克隆：通过无性繁殖连续传代形成的群体（即无性繁殖系）。1.在分子水平，克隆一般指基因克隆。2.在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体单克隆抗体3.在个体水平，克隆是指通过特定个体的单个体细胞进行无性繁殖，从而产生新个体的过程或者技术应用基因克隆和细胞克隆是现代生物技术中的关键技术1.基因工程克隆，重组质粒复制，分子水平2.微生物克隆，单克隆抗体增殖，细胞水平3.个体水平上的克隆，动植物体细胞克隆个体，动物胚胎细胞克隆个体注：胚胎细胞克隆不属于严格意义上的克隆，体细胞克隆属于严格意义上的克隆条件理论上是：细胞具有的发育全能性.１、具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞；２、能有效调控细胞核发育的细胞质物质；３、完成胚胎发育的必要的环境条件。(核移植)定义：动物核移植是将动物的一个细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体种类胚胎细胞核移植，体细胞核移植体细胞核移植过程•屠宰场收集牛卵巢，采集卵母细胞，体外培养到MII期，然后去核•从供体奶牛身体某一部位取体细胞，体外培养•将供体细胞注入去卵母细胞•通过电刺激(物理或化学方法)刺激两细胞融合，构建重组胚胎•移入受体(代孕)母牛体内应用体细胞核移植技术用于人类疾病治疗取出的干细胞要进行[动物细胞培养]，这个过程需要向培养液中加诱导物。两周后，镜检发现培养的细胞呈胰岛样细胞的变化，这一过程称为[诱导分化(细胞分化)]培养液中加入[分化诱导]因子，可诱导该种干细胞形成不同类型的组织细胞植物组织培养的原理：[细胞全能性]➔分子与细胞－细胞的增殖与分化植物组织培养•植物组织培养－基因工程相关‡•科研人员常用[植物组织培养]方法保持转基因的优良性状•将转入的抗盐基因的烟草细胞培养城完整的植株需要用[植物组织培养]技术•目的基因导入棉花首体细胞后，培育成抗虫棉的过程所采用的技术是[植物组织培养]•将转入抗盐基因的烟草细胞培育成完整的植株需要用[植物组织培养技术]•定义：在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配置的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整植株•原理：细胞全能性•条件：离体培养•若要使高度分化的细胞恢复分裂能力，首要条件是[离体培养]•过程•脱分化，再分化•离体叶片、组织→愈伤组织：箭头表示[脱分化]过程•愈伤组织经[再分化(细胞增殖和分化)]进而形成完整植株•★培养基还需添加植物激素，目的是诱导外植体[脱分化、再分化]not生根、发芽•★在培养过程中，细胞必须经过[脱分化、再分化]过程才能形成胚状体或丛芽•愈伤组织•植物组织培养获得提取产物，是通过[愈伤组织]获得的not外植体or再分化后的组织器官•➔其他－培养基•植物组织培养－应用•微型繁殖(快速繁殖)技术：保持优良品种的遗传特性，高效快速地实现种苗的大量繁殖•作物脱毒：分生区附近(如茎尖)的病毒极少，目前采用茎尖组织培养技术来脱毒，脱毒苗•为了获得脱毒植株，外植体往往取自植物的花芽、叶芽等处的分生组织，其原因是[这些部位很少受到病毒等病原体的侵害]•人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽、腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到的中子。人工种子在适宜条件下同样能够萌发长成幼苗•育种相关•植物组织培养还广泛用于[单倍体育种]，[诱变育种]，[基因工程育种]，[细胞工程育种]等育种过程中动物细胞培养•定义从动物机体取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长增值•过程•分散成许多单个细胞，胰蛋白酶、胶原蛋白酶•细胞悬液，细胞贴壁，接触抑制•原代培养：动物组织消化后的初次培养•传代培养：贴满瓶壁细胞用胰蛋白酶处理，分瓶，继续增殖•10～50代，增殖开始缓慢，之后向癌细胞发展•放入液体培养基中经机械作用分散成单个细胞，制备细胞浮液，再经过[细胞培养(细胞分裂)]即可获得大量细胞•条件1.无菌、无毒环境：加抗生素防止污染，定期更换培养液2.营养：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素；合成培养基3.温度和pH4.气体环境：CO2、O2；CO2培养箱，维持培养液pH•应用1.病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.基因工程受体细胞3.检测有毒物质，判断物质的毒性细胞融合植物体细胞杂交•定义将不同的植物体细胞在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术•过程•纤维素酶、果胶酶除去细胞壁，获得具有活性的原生质体•蜗牛酶，其作用是去细胞壁•原生质体融合，人工诱导：物理法(离心、振动、电激)，化学法(聚乙二醇PEG诱导剂)动物细胞融合(细胞杂交)•定义两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程•融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为[杂交细胞]•过程动物细胞融合，常用的诱导因素：聚乙二醇PEG、灭活的病毒、电激•动物细胞融合除了采用植物细胞原生质体融合常用诱导剂外，还可以采用[灭活病毒]、[电刺激]诱导因素原生质体融合动物细胞融合物理离心、振动、电激电激化学和生物，诱导剂聚乙二醇（PEG）聚乙二醇(PEG)灭活的病毒•意义：细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交称为可能单克隆抗体•基础•单克隆抗体是在动物细胞培养技术和[动物细胞融合]技术的基础上发展起来的•[动物细胞培养]技术是单克隆抗体技术的基础•特点细胞A体外培养不具有分裂能力，但能[分泌特异性抗体]，细胞B体外能够[无限增值]★单克隆抗体细胞(杂交瘤)的特点是[既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体]★单克隆抗体(技术)的特点是[特异性强，灵密度高，并能大量制备]•过程•采集：制备单克隆抗体所用的B淋巴细胞一般从脾中采集•融合：在制备单克隆抗体，细胞融合阶段，用[B淋巴细胞]与骨髓瘤结合•筛选I－筛选出杂交瘤细胞•选择性培养基进行筛选，筛选出融合的杂交瘤细胞•细胞融合是随机过程，在HAT培养基中培养，要筛选出[杂交瘤]细胞•在培养基中，要筛选出[杂交瘤细胞]•筛选II－筛选出能分泌所需抗体的细胞：对已筛选出的杂交瘤细胞，还需要进行克隆培养和抗体监测经多次筛选可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞•培养2周后，即测定培养细胞的特征，筛选出[特异性分泌{XX}抗体]的细胞•经过多次筛选最终得到能分泌[特定抗体]的杂交瘤细胞•培养，增殖：将杂交瘤细胞在体外培养，或注射到小鼠腹腔体内培养。•要获得大量的单克隆抗体，可对获得的杂交瘤细胞进行[体外或体内]培养。•应用•欲检测胰岛素的分泌量，还可以通过[单克隆抗体]技术制备抗胰岛素抗体•对释放外毒素A的脓杆菌的感染