选择性阻断cGMP依赖性蛋白激酶对内毒素孵育的大鼠血管环收缩功能的影响

期刊文献选择性阻断cGMP依赖性蛋白激酶对内毒素孵育的大鼠血管环收缩功能的影响郭君1王学敏2支建明3王海燕2刘文涛1薛瑛2（1.苏州大学，苏州215006；2.上海交通大学附属第六人民医院麻醉科，上海200233；3.上海交通大学医学院生理教研室，上海200025）摘要：目的观察选择性阻断cGMP依赖性蛋白激酶（PKG）对恢复内毒素（LPS）孵育的大鼠血管环收缩功能的作用。方法取SD大鼠胸主动脉血管环，随机分为四组：对照组、LPS组、LNAME组以及DT2组。在体外测定LPS孵育2h,3h,4h后各组血管环在苯肾上腺素（PE）作用下收缩的浓度效应曲线、最大收缩（Emax）以及产生最大收缩力的半数有效浓度（EC50）。结果LPS孵育后各时间点血管环的收缩浓度效应曲线与对照组比较明显降低（P0.05）。LNAME可以提高LPS孵育2h,3h,4h时血管环的收缩功能，Emax,EC50较LPS组差异明显（P0.05）。DT2可以显著提高LPS孵育3h时血管环的收缩功能（P0.01），Emax,EC50有显著差异（P0.01），但在2h,4h时，DT2组与LPS组血管环收缩的浓度效应曲线比较没有统计学差异。结论选择性阻断cGMP依赖性蛋白激酶可以部分恢复LPS孵育的大鼠胸主动脉血管环的收缩功能。关键词：脓毒症休克；内毒素；血管环；cGMP依赖性蛋白激酶EffectofselectiveblockadecGMP-dependentproteinkinaseonthesystolicfunctionofrats’thoracicaorticringsincubatedwithendotoxinGUOJun1,WANGxue-ming2,WANGhai-yan2,LIUwen-tang1,ZHIjian-min3,XUEYing2作者简介：郭君(1983-)，女，硕士生；电子信箱：[e-mail]通讯作者：王学敏，电子信箱：[e-mail]期刊文献(1.SoochowUniversity,Suzhou215006,China;2.DepartmentofAnesthesiology,TheSixthPeople’sHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200233,China;3.DepartmentofPhysiology,BasicMedicalCollege,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200025,China)Abstract：ObjectiveToobservetheroleofselectiveblockadecGMP-dependentproteinkinaseonrecoverycontractilityoftherataorticringsincubatedwithendotoxin(LPS).MethodsTheSDratthoracicaorticringswererandomlydividedintofourgroupsasfollows:Controlgroup,LPSgroup,LNAMEgroupandDT2group.Meanwhilethecontractiveconcentrationresponsecurvesofvascularrings,EmaxandEC50ofeachgroupofvascularringstophenylephrine(PE)weremeasuredatdifferenttimes(2h,3h,4h)invitro.ResultsThecontractiveconcentrationresponsecurveofvascularringsincubatedwithLPSwassignificantlylowercomparedwithcontrolgroup(P0.05).LNAMEeffectivelyimprovedthevascularsystolicfunctionafterincubationwithLPSfor2h,3hand4h;theEC50,EmaxwereofsignificantdifferencecomparedwithLPSgroup(P0.05).DT2significantlyenhancedthecontractilefunctionofvascularringsafterincubationwithLPSfor3h;EC50,EmaxwereofsignificantdifferencecomparedwithLPSgroup(P0.01);however,theconcentrationresponsecurveofDT2grouphadnosignificantdifferencecomparedwithLPSgroupat2hor4h.ConclusionSelectiveblockadeofcGMP-dependentproteinkinasecanpartiallyrecoversystolicfunctionoftherataorticringsbeingincubatedwithLPS.Keywords:septicshock;endotoxin(LPS);vascularrings;cGMP-dependentprotein期刊文献kinases脓毒症是创伤、休克、感染和大手术后患者的重要并发症之一，脓毒症休克是ICU患者死亡的主要原因，其死亡率高达30-45%[1]。脓毒性休克的终末期往往表现为严重的低血压和血管麻痹，最终导致一个或多个器官功能障碍。研究表明，一氧化氮（NO）的过量生成是脓毒性休克血管低反应性的主要原因之一，但NO本身还有抗氧化、抗凋亡等保护作用，所以在脓毒性休克时完全抑制NO的生成虽然可以提高血压，但动物的死亡率却升高[2]。因此目前的研究主要着眼于选择性阻断NO通路的下游环节。NO进入细胞后可激活cGMP依赖性蛋白激酶（PKG），PKG的磷酸化可通过激活大电导钙离子依赖性钾离子通道，外向电流增加，引起细胞膜超极化；抑制L型Ca2+通道，使钙内流减少；激活钙泵（Ca2+Mg2+ATP酶）的使钙外流增加；促进Na+/Ca2+大量交换等通路引起肌球蛋白轻链去磷酸化，使血管平滑肌舒张[3]。但是选择性阻断PKG对脓毒症时血管功能的影响以往未有报道。本研究通过体外观察LPS孵育大鼠血管环收缩功能的变化，探讨在脓毒性休克时选择性的阻断PKG以恢复血管反应性的可能性。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物：健康雄性SD大鼠，体重250-300g，购自中国科学院上海实验动物中心。动物生产许可证号：SCXK（沪）2004-0005，使用许可证号：SYXK（沪）2007-0007。1.1.2主要试剂及仪器：内毒素（LPS，Escherichiacoli055:B50）、乙酰胆碱、N-硝基精氨酸甲酯（L-NAME，一氧化氮合酶抑制剂）、DT-2（特异性PKG抑制剂）均购自美国sigma公司，苯肾上腺素（PE,上海禾丰制药有限公司），ALC-M期刊文献离体组织器官实验装置（上海奥尔科特生物科技有限公司）。1.2离体血管环的制备及分组：将大鼠用0.5%戊巴比妥钠溶液（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，开胸取出胸主动脉，在预冷的PBS中洗净，去除血管周围的结缔组织，将主动脉剪成2-3mm长的血管环。分为4组：对照组，LPS（75ug/ml）组，LNAME（LPS75ug/ml+L-NAME0.1mM）组，DT2（LPS75ug/ml+DT-22×10-3mM）组；分别检测LPS孵育2h,3h,4h后各组血管环对不同浓度PE收缩反应的浓度效应曲线、EC50以及Emax,L-NAME和DT-2在测定反应性前0.5h加入。1.3血管环收缩功能的测定：将大鼠胸主动脉血管环挂在充有Krebs-Henseleit液(NaCL118mmol／L，KCL4.7mmol／L，NaHCO325mmol／L，KH2PO41.03mmol／L，MgS04·7H2O0.45mmol／L，葡萄糖11.1mmol／L，CaCL22.5mmol／L，pH7.4)的离体器官灌流槽中，持续充入95％的O2和5%的CO2混合气体，每15分钟换液1次，血管环初张力1.5g，37℃孵育60min。实验前给予60mmol/LKCl诱发血管环收缩，连续两次最大收缩反应之差大于10％的血管弃去。以10-6M的PE刺激血管环,达到最大收缩幅度后给予10-5M的乙酰胆碱舒张血管，若舒张幅度80％表示血管内皮受损，血管弃去。冲洗至刺激前的状态，稳定30min后加入LPS孵育2h,3h,4h。采用PE累积浓度法绘制血管收缩浓度梯度反应曲线，测定血管在PE刺激下的最大收缩力（Emax），并计算产生最大收缩力的半数有效浓度（EC50）[4]，它们分别代表了药物作用的效力和潜力。1.4统计学处理采用SAS8.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，血管环对PE浓度梯度反应曲线的比较采用双因素方差分析，以CONTRAST检验作曲线间两两比较。各时间点Emax,EC50的比较采用单因素方期刊文献差分析的Tukeys检验。P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1不同时间点各组浓度梯度反应曲线的比较与对照组相比，LPS孵育2h后，血管环的收缩功能较对照组明显降低，两反应曲线差异明显（P0.05，图1a）；LNAME组与LPS组相比血管环的收缩功能升高(P0.05)；而DT2组血管环的收缩功能虽然较LPS组有所升高但差异不明显。LPS孵育3h后血管收缩功能与对照组相比显著降低（P0.01，图1b）；LNAME组浓度效应曲线接近对照组，与LPS组差异显著（P0.01）；DT2组血管环的收缩功能增强与LPS组差异明显（P0.01）。第4h时LPS孵育的血管收缩功能显著降低（P0.01，图1c）；LNAME组血管环的收缩功能部分恢复，但与对照组比较差异明显（P0.05）；DT2组与LPS组比较变化不明显。2.2不同时间点各组血管环EC50和Emax的比较LPS组各时间点的EC50较对照组均明显增加（P0.05），Emax均显著降低（P0.01，表1）。跟LPS组比较2h,4h时LNAME组EC50明显降低（P0.05），3h时降低显著（P0.01）。各时间点Emax较LPS组均显著升高（P0.01，表1）。在3h时DT2组EC50较LPS组显著降低（P0.01），Emax显著升高（P0.01）；而2h,4h时DT2组EC50、Emax与LPS组比较没有统计学差异（表1）。图1.不同时间点大鼠胸主动脉离体血管环对PE反应的浓度效应曲线(x±s,n=5)Fig1.Phenylephrine(PE)log-doseresponsecurvesinratthoracicarteriesatdifferent期刊文献time(x±s,n=5).A,B,CrepresentsPElog-doseresponsecurvesinratthoracicarteriesat2h、3h、4hrespectively.A.B.期刊文献C.*P0.05,**P0.05vscontrolgroup;#P0.05,##P0.01vsLPSgroup表1.不同时间点各组EC50、Emax的比较(x+s,n=5)Tab1.ThecomparisonofEC50、Emaxforeachgroupatdifferenttime(x+s,n=5)Group2h3h4hEC50(nM)Emax(g)EC50(nM)EmaxEC50(nM)EmaxControl156.06±52.1383.15±0.06107.36±9.683.16±0.09146.54±31.193.05±0.08LPS