药物分析第十六章抗生素类药物的分析

第十六章抗生素类药物的分析药物分析教研室1Contents概述1β-内酰胺类2氨基糖苷类3四环素类4高分子杂质检查52在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称抗生素（antibiotics）定义3来源•生物合成（发酵）•化学合成或半合成特点•化学纯度较低-同系物、异构体及降解物多•活性组分易发生变异-微生物菌株或者发酵条件的改变都会导致产品质量发生变化•稳定性差-活性中心往往是活泼基团，不稳定4按化学结构和性质分类•β-内酰胺类（β-lactam）含有β-内酰胺类结构的抗生素，如青霉素、头孢菌素、碳青霉素烯类等等；•四环素类：含有四并苯的木考核，如四环素、土霉素、金霉素等；•氨基糖苷类：结构中含有氨基糖苷和氨基环醇，如链霉素、庆大霉素等•大环内酯类：含有大环内酯作为配糖体，如红霉素，螺旋霉素等；•多肽类：抗菌肽，万古霉素、多粘菌素B等；•抗肿瘤类：丝裂霉素、平阳霉素等；•其他类5按照生物来源分类•细菌产生的抗生素如多粘菌素和杆菌肽。•真菌产生的抗生素如青霉素及头孢菌素，现在多用其半合成产物。•放线菌产生的抗生素放线菌是生产抗生素的主要来源。其中链霉菌和小单孢菌产生的抗生素最多。常见的抗生素包括链霉素、卡那霉素、四环素、红霉素、两性霉素B等。6抗菌药物的作用机制根据对病原菌的作用靶位，将抗生素的作用机制分为四类•抑制细菌细胞壁合成•影响胞浆膜通透性（多粘菌素）•抑制蛋白质合成（大环内酯类、氨基糖甙类）•抑制核酸代谢：叶酸代谢；核酸合成（喹诺酮、磺胺类）7抗菌药物的主要作用部位喹诺酮类林可霉素类氨基糖苷类酮康唑环丝氨酸利福平红霉素制霉菌素杆菌肽甲氧苄胺嘧啶四环素类两性霉素B万古霉素磺胺药氯霉素多粘菌素类β-内酰胺类核酸合成细胞蛋白合成细胞膜渗透性细胞壁8耐药分类(一)固有耐药（intrinsicresistance）固有耐药性指细菌对某些抗菌药物的天然不敏感。固有耐药性细菌称为天然耐药性细菌，其耐药基因来自亲代，由细菌染色体基因决定而代代相传的耐药性，存在于其染色体上，具有种属特异性。如肠道杆菌对青霉素的耐药，固有耐药性始终如一并可预测。（二）获得耐药（acquiredresistance）在原先对药物敏感的细菌群体中出现了对抗菌药物的耐药性，这是获得耐药性与固有耐药性的重要区别。9产生钝化酶使抗菌药物失效药物作用靶位的结构和数量改变——抗菌药不易与细菌结合主动外排机制——药物被泵出菌体外10产品稳定性差分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用发酵过程不易控制易受污染生产工艺复杂发酵液中杂质无机盐、脂肪、各种蛋白质、各种降解产物、色素、热原、毒性物质11抗生素质量分析——生物学法、物理化学法鉴别：理化方法(主要方法)、微生物法官能团的显色反应，如：β-内酰胺环的羟肟酸铁反应；链霉素的麦芽酚反应、坂口反应；光谱法：红外光谱及紫外吸收光谱的鉴别。色谱法：HPLC和TLC法，采用标准品对照品对照法；生物学法：比较抑菌能力，现已少用。12检查：影响产品稳定性的检查项目：结晶性、酸碱度、水分或者干燥失重等控制有机和无机杂质的项目：溶液澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属等；与临床安全性有关的检查项目：异常毒性、热源或细菌内毒素、降压物质、无菌等13效价：每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。由单位（u）或微克（μg）表示。各种抗生素的效价基准是人们为了生产科研方便而规定的。1mg青霉素钠定为1670单位；1mg庆大霉素定为590单位。相应的盐可以通过分子量与标准盐类进行换算。抗生素活性表示方法14含量/效价测定：微生物法：与临床疗效吻合,灵敏度高，结果直观，适用范围广；但操作复杂费时，误差大理化方法：准确度与专属性较高,且操作简便；但与临床疗效有偏差15NSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）6-aminopenicillanicacid简称6-APA青霉素类7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）?RCO7-aminocephalosporanicacid,简称7-ACA头孢菌素类氢化噻唑环氢化噻嗪环＊＊＊＊16CONSOHNCOOHCH3CH3CH2青霉素(苄青霉素)(penicillins)CHCOHNNH2NSCH3CH3COOHO氨苄西林CHCOHNNH2HONSCH3CH3COOHO阿莫西林17CHCOHNNH2CH3NOSCOOH头孢氨苄CH3NOSCOOHCHCOHNNH2头孢拉定CH3NOSCOOHCHCOHNNH2HO头孢羟氨苄SCH2CONONHSCH2OCOCH3COONa头孢噻吩钠18一、结构与性质1.酸性（羧基）pKa2.5-2.8，酸性较强。碱金属盐水溶性好，有机碱盐难溶于水。2.手性C（旋光性）NSO1234567NOS12345678﹡﹡﹡﹡﹡193.UV青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构260nm204.β–内酰胺环(四元环张力+酰胺键)干燥条件较稳定，溶液不稳定失效降解青霉素类酸、碱、青霉素酶某些氧化剂、金属离子、温度失效降解头孢菌素类酸、碱、胺类内酰胺酶21二、鉴别试验(一)色谱法HPLC(tR)TLC(Rf)(二)光谱法IRUVNMR22NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH223(三)呈色反应1）羟肟酸铁反应——β–内酰胺环β–内酰胺类NH2OH·HClNaOH羟肟酸Fe3+H+显色（红、棕、褐）2）类似肽键（-CONH-）a.茚三酮反应——α-氨基CNH2H+OOHOHOCOHONCOO+CO2+3H2O24b.双缩脲反应——β–内酰胺类碱性酒石酸铜紫色2OHCONH2CuCOHNCCH3COONaCH3SNHNCH3CH3COONaCSNOHOHOOCH2NH2CH2HH253）其他呈色反应橙黄色重氮苯磺酸OHHC56（偶合）呈暗黄色氨苄西林水浴加热甲醛硫酸水湿润-青霉素钾和青霉素钠呈红棕色(四)各种盐的反应焰色反应——K+、Na+26(聚合物、有关物质、异构体等)1.聚合物头孢他啶中聚合物测定—分子排阻色谱凝胶色谱分子筛机制主成分自身对照法面积归一化法限量法自身对照外标法OOOHOOHCH2OOOHOOHCH2OOOHOOHCH2OOOHOOHCH2OOHOOHCH2OOCH3OHOHOOOCH2OHHOOOOHOHOOH2COOOOOHHOH2COOH2COHHOOCH2OOOH2COOHHOOOOOHOOHCH2OOCH2OHHOOOOOCH2OHHOOOOCH2OHHOOOOH2COHHOOOOCH2OHHOOOOOOHOHOH2COOH2COHOCH2OHHOOOH2COCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHHCOHCH2CH2CH2HCOH萄聚糖凝胶立体网状结构图三、杂质检查272.有关物质与异构体头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查取本品适量，精密称定，加流动相制成约含0.25mg/ml的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相制成2.5g/ml的溶液，作为对照溶液。取对照溶液20l注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%，再取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的3.5倍，供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，其中E异构体峰面积不得大于对照溶液主峰面积之和(1.0%)，△3-异构体峰面积不得大于1.5倍(1.5%)，其余单个杂质峰面积的和不得大于3倍(3.0%)。(供试品溶液中任何小于对照品溶液主峰面积之和0.05倍的峰可忽略不计)28•青霉素钠(钾)的吸光度检查：–本品加水制成每1mL含有1.80mg的溶液，照UV-Vis法，在280nm波长处测定吸光度，不得大于0.10；在264nm波长处有最大吸收，吸光度应为0.80-0.88.–该法264nm处吸收值用来控制青霉素钠(钾)的含量，280nm处吸收值用来控制杂质的含量。3.UV294.有机溶剂：用GC法或者HPLC法5.结晶性第一法(偏光显微镜法)第二法(X射线粉末衍射法)30四、含量测定碘量法汞量法酸碱滴定法羟肟酸比色法HPLC法31阿莫西林克拉维酸钾片色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠7.8g，加水900ml溶解，用磷酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至4.4±0.1，加水稀释至1000ml)-甲醇(95:5)为流动相；流速为0.7ml/min；检测波长为220nm。阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于3.5测定法取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉维酸0.25mg的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。32碱性环己多元醇+氨基糖→苷链霉素(Streptomycin)33巴龙霉素(paromomycin)OCH2OHHOOHNH2OOHNH2H2NOOHOOOR2OHHOH2NCH2OHR1D-葡萄糖胺脱氧链霉胺巴龙胺D－核糖巴龙霉糖巴龙二糖胺34庆大霉素(Gentamycin)35一、结构与性质1）溶解度（氨基、羟基）：水溶性2）碱性（氨基）：临床应用其硫酸盐；溶于水，但不溶于有机溶剂；3）旋光性（糖）：多个手性碳4）稳定性（苷）：强酸、碱条件均可水解；临床使用时对pH值有很高的要求；5）紫外吸收光谱361.茚三酮反应——羟基胺类,α-氨基酸蓝紫色庆大霉素链霉素茚三酮△二、鉴别反应372.Molisch试验——五碳糖或六碳糖结构OHOH2CCHOOHOHOH2CCHOHOH红紫色羟甲基糠醛(含六碳糖结构氨基糖苷类酸性水解产物)a.α-萘酚OHOH2CCHOoOH2CCHoob.萘酮蓝紫色383.N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）甲基葡萄糖胺庆大霉素链霉素水解N乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+红色394.麦芽酚反应——链霉糖特有反应紫红色麦芽酚链霉糖链霉素分子重排3OHFeH+40NHCNH2HOOHOHNHCH2NOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHNHNHCH3H2ONaOHOOOHCH3OOCH3Fe3+H+OFe33+/紫红麦芽酚415.坂口反应——链霉胍特有反应橙红羟基喹啉链霉胍链霉素次溴酸钠8OH（或α-萘酚）42NHCNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3坂口反应麦芽酚反应N-甲基葡萄糖胺反应436.硫酸盐反应7.色谱法：TLC和HPLC法8.光谱法：IR、UV44三、杂质检查1.链霉素中链霉素B（甘露糖链霉素）的检查来源：发酵中产生方法：TLC中的对照品法2.硫酸奈替米星中西索米星的检查(TLC)3.庆大霉素C组分的测定45四、含量测定微生物检定法平行反应，检测同等量下供试品和对照品对微生物的抑制作用；管碟法：利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品和供试品对菌群产生的抑菌圈大小；浊度法：通过抗生素在液体培养基中对细菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品和供试品抑菌程度，测定供试品效价；--该法优点：灵敏度高、量少、直观；与临床要求一直；使用范围广；是效价测定的最基本方法；目前分子结构复杂、多组分抗生素，首选该法测效价。--该法缺陷：操作步骤多，时间长，误差大。46HPLC法有紫