烟草转化及CoIP方法

CoIPprotocolFromGuoSiyi烟草转化体系将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在YEB液体培养基中培养过夜，到OD600约1.5左右（大约20h），同时摇菌P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。然后收集菌体，5000rpm5min常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10mMMES，100μMAS-乙酰丁香酮，50mMMgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定OD600值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入P19，最终使得每种菌液成分的OD600在0.8左右；然后将混合的菌液在28℃下以200rpm的转速再培养至少3h，然后注射合适大小的烟草叶片。尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养2d，然后再转入光下培养2-3d，并取材在荧光显微镜下观察GFP的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。免疫共沉淀（CoIP）将VER2，TaGRP2与不同的标签蛋白融合如FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。至少设定两组样品：即FLAG-VER2/TaGRP2-GFP以及FLAG-VER2/GFP。检测目的蛋白是否表达：用Bradford法测定提取蛋白的浓度，然后用SDS-PAGE分离蛋白（15-30μgprotein/lane）做WesternBlot用（WB）标签抗体FLAG，GFP检测融合蛋白是否在烟草中表达。并根据WB的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行）取两份30μLproteinA/Gbeads到EP管中放于冰上，用600μL的蛋白提取buffer重悬beads，4℃离心1000g1min。冰上静止1min，弃上清。（重复此操作3次）将适量蛋白溶液（根据WB结果，调整实验组和对照组蛋白样品，使得目的蛋白的表达基本相当，总蛋白在400-600μg，溶液总体积在1mL左右，可用蛋白提取buffer补齐）加入beads中，4℃颠倒混匀1-2h；然后4℃离心2000g1min，将上清转移至新EP管中，取20μL样品待用，即Input。免疫沉淀：将上清中加入适量的GFP抗体，根据WB结果来加，10-20倍于WB的抗体用量。4℃颠倒混匀1-2h，快到时间时，重新准备两份30μLproteinA/Gbeads在新EP管中放于冰上待用（用蛋白提取buffer重悬3次）。将混匀的蛋白+抗体溶液加入含有beads的EP管中，4℃颠倒混匀1-2h。清洗杂蛋白：4℃离心1000g1min，将上清转移到新EP，此为UBP（unbindingprotein），存于冰上待用。将beads用washbuffer清洗4-5次，600μL/次，每次重悬后4℃离心1000g1min。留40μL最后一次的washbuffer（即W5）于冰上待用。洗脱结合蛋白：将beads用50μLelutionbuffer洗脱后加10μL6×SDSloadingbuffer，或者用60μL1×SDSloadingbuffer煮沸5min。WB检测FLAG-VER2蛋白是否与TaGRP2-GFP蛋白共沉淀将洗脱后的样品Elution及UBP，W5及Input（实验组+对照组共8个样品）跑SDS-PAGE电泳并用FLAG抗体做WesternBlot检测实验组中是否有FLAG-VER2的信号带，如有则VER2/TaGRP2互作，同时对照组中不能有FLAG-VER2的信号带，并且W5中不能有信号带。同时用GFP抗体确保TaGRP2-GFP/GFP分别在两组elution中都能有信号即保证用GFP抗体做的免疫沉淀成功。