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河南农业大学牧医工程学院2007届动物科学专业毕业论文（页眉小五宋体居中）1（二号黑体空行）固始鸡免疫器官内细胞凋亡基因Fas和FasL的动态表达（论文题目二号黑体居中）（二号黑体空行）梅承君（四号仿宋居中）（2007届动物科学专业1班）（五号楷体居中）（五号楷体空行）摘要（小五黑体）：为探讨（小五楷体。论文英文、英文缩写和阿拉伯数字均用TimesNewRoman格式）固始鸡免疫器官内细胞凋亡基因Fas和FasL的动态表达（目的），应用免疫组织化学技术和Leica显微图像处理系统，对细胞凋亡基因Fas和FasL在固始鸡免疫器官内的动态表达进行了研究（方法）。结果：Fas在不同发育阶段固始鸡免疫器官内均有表达，但表达量均不相同，呈波浪样动态变化；Fas表达于固始鸡免疫器官内淋巴细胞细胞膜和细胞质，不表达于细胞核；Fas表达阳性细胞在固始鸡不同免疫器官内分布位置不同，呈散在或簇团状分布：法氏囊内阳性细胞主要分布于黏膜靠近上皮细胞的固有膜层内、淋巴小结与淋巴小结之间区域、淋巴小结边缘，淋巴小结内少量淋巴细胞也有Fas表达；胸腺内主要分布于胸腺小叶髓质，极少出现在皮质内；脾脏内主要分布于红髓和边缘区、淋巴小结周围和动脉周围淋巴鞘周围的区域，动脉周围淋巴鞘极少有Fas表达，淋巴小结无Fas表达。FasL在固始鸡免疫器官内的表达与Fas相似，但表达量与Fas相比较少（结果）。以上结果表明，细胞凋亡基因Fas和FasL参与了固始鸡免疫器官内淋巴细胞发育分化过程中的凋亡调控，并对免疫器官的稳定发挥重要作用（结论）。关键词（小五黑体）：细胞凋亡；Fas；FasL；凋亡基因表达；免疫组织化学；免疫器官；固始鸡（小五号楷体）（五号楷体空行）DynamicExpressionofApoptosisGeneFasandFasLinImmunityOrgansofGushiChickens（三号TimesNewRoman居中，实词首字母均应该大写）（五号楷体空行）MEICheng-jun（四号TimesNewRoman居中）(Class1ofAnimalScience,Graduatedin2007)（小四TimesNewRoman居中，实词首字母均应该大写）（小四楷体空行）Abstract（小五TimesNewRoman加黑）:Dynamic(小五TimesNewRoman)expressionofapoptosisgeneFasandFasLinimmunityorgansofGushichickens(Objective)wasstudiedbyusingtheimmunohistochemicaltechniquesandLeicaimage-processingsystem(Method).TheresultsshowedthatFasgeneexpressedintheimmunityorgansatdifferentdevelopmentalstages,buttheexpressionproductsvariedandthedynamicchangeswerewave.Fasexpressedinthecellmembraneandthecytoplasmintheimmunityorgans,whilenegativelyinthenucleusoflymphocytes.Fasgenepositivelyexpressedcellsdistributedinthevariouslocationinthedifferentimmunityorgans,scatteredlyorinclusters.Thepositivelyexpressedcellsinthebursaweremainlyfoundinthelaminapropriaofmucousmembrane,amongthelymphoidnodulesand河南农业大学牧医工程学院2007届动物科学专业毕业论文（页眉小五宋体居中）2attheedgesoflymphoidnodules.Fasalsoexpressedinafewlymphocytesinsidethelymphoidnodules.Thepositivecellsinthethymuslocalizedmainlyinthethymicmedulla,andafewinthethymiccortex.Faspredominantlyexpressedintheredpulp,themarginalzones,andthezonesaroundthesplenicnodulesandtheperiarteriallymphaticsheathinthespleen.TheexpressionofFasgenewasfaintlypositiveintheperiarteriallymphaticsheathandnegativeinthesplenicnodules.TheexpressionofFasLintheimmunityorgansofGushichickenswassimilartothatofFas,buttheexpressionproductofFasLwaslessthanthatofFas(Results).AllresultsmentionedaboveindicatedthatFasandFasLgenesparticipatedintheregulationofthelymphocytesapoptosisintheimmunityorgansofGushichickens,andplayedtheimportantrolesinkeepingtheimmunityorgansstable(Conclusion).（英文摘要尽量用过去时和被动语态；坚决不能用在线翻译）Keywords（小五TimesNewRoman加黑）:Apoptosis;Fas;FasL;Expressionofapoptosisgene;Immunohistochemistry;Immunityorgan;Gushichicken（关键词要用实词，小五TimesNewRoman，首字母均应大写，关键词之间用“;”号隔开）（四号楷体空行）细胞凋亡（正文用五号宋体）是生物界广泛存在的一种重要的生命过程，是多细胞动物为调节机体发育、维护内环境稳定、有基因调控的细胞主动性死亡过程。Fas与Apo-1是同一种跨膜糖蛋白分子，在结构和功能上属于肿瘤坏死因子（TZF,tumornecrosisfactor）（正文英文五号TimesNewRoman格式）受体和神经生长因子受体（NGFR,nervegrowthfactorreceptor）的家族成员，它与细胞上的某些分子(FasL)交联可诱导细胞凋亡的发生。FasL（Fasligand）是Fas的配体（Fas是FasL的受体）。FasL主要在被激活的T细胞和B细胞上表达。当Fas抗原和FasL结合后，可以诱发Fas表达，细胞发生凋亡。Fas和FasL在免疫系统细胞上的表达相对较高，其介导的细胞凋亡在淋巴细胞的发育和凋亡中发挥重要作用[1,2]（参考文献用顺序著录法，文献序号上标）。Fas系统功能正常对机体自身稳定具有重要作用，Fas功能过强或缺陷均可导致疾病发生[2]。前人对Fas和FasL在许多器官内的表达及其意义均有研究。在大鼠心脏移植[3]、大鼠急性肝损伤[4]、大鼠急性肺损伤[5]、大鼠肝癌组织[6]、人肝癌组织[7]、人肺癌组织[8]、人甲状腺癌组织[9]、人胃癌组织[10]、人肾癌和肾组织[11]等器官组织中均有Fas和FasL表达，Fas和FasL介导了该组织细胞的凋亡过程。前人研究结果也表明了不同家禽免疫器官细胞存在着自然凋亡现象[12~16]。刘玉锋等[17~19]用不同毒力鸡传染性法氏囊病病毒感染36日龄SPF蛋鸡，结果表明强毒株病毒可以诱导免疫器官淋巴细胞Bcl-2和Bax表达。祁保民等[20]用免疫组织化学方法研究了马立克氏病毒人工感染鸡的脾脏等多种组织的实质细胞细胞凋亡病变及FasL表达。固始鸡是中国著名的地方鸡品种之一，作为优良地方品种资源被载入《中国家禽品种志》。用免疫组织化学技术研究凋亡基因Fas和FasL在固始鸡免疫器官内淋巴细胞自然凋亡过程中的动态表达，未见前人报道。研究不同发育阶段固始鸡免疫器官淋巴细胞凋亡机制，对研究免疫器官的稳定、环境与动物有机体，特别是与免疫的关系[21~25]，调节免疫器官发育，制定合理的免疫程序等都具有重要意义。1材料与方法（一级标题，四号黑体）1.1试验地点、时间（二级标题，五号黑体）本试验研究于2007年3月至5月间在河南省家禽种质资源创新工程研究中心进行。1.2实验动物分组和取材试验用固始鸡由河南省家禽种质资源创新工程研究中心提供。1w、4w、8w、12w、16w、20w6组健康正常发育的固始鸡，每组5羽，雌雄不限。所取免疫器官（法氏囊、胸腺和脾脏）放入体积分数10％中性福尔马林溶液中，固定12h左右，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。1.3主要试剂兔抗Fas多克隆抗体（第一抗体）和兔抗FasL多克隆抗体（第一抗体）：浓缩型，购自福州迈新生物技术开发有限公司。工作浓度1:100。河南农业大学牧医工程学院2007届动物科学专业毕业论文（页眉小五宋体居中）31.4主要仪器设备显微图像处理系统：Leica显微图像处理系统（LeicaMicrosystems），美国Leica公司生产。显微镜：LeicaDM2000；摄像头：CH-9435Heerbrugg(DFC320)；软件处理系统：LeicaQWin软件。1.5操作过程和方法常规石蜡切片，片厚6～8µm。免疫组织化学SP法染色，其中按抗体要求进行组织高温抗原修复，苏木精复染。切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。应用Leica显微图像处理系统，在光镜下对切片进行观察、记录和照相。1.6数据统计分析试验数据应用SAS(6.12)软件进行分析处理。显著性检验采用onewayANOVA方法，用Duncan多重比较检验不同发育阶段的差异，P0.01即认为有差异显著性，所有结果均以平均值和标准差来表示。2结果与分析免疫组织化学结果的判定参照标准（阳性细胞判定标准）：经免疫组织化学染色的切片，背景无色或浅蓝色。Fas和FasL的免疫阳性产物为棕黄色颗粒或团块，表达于固始鸡免疫器官淋巴细胞细胞膜和细胞质，致使整个阳性细胞呈棕黄色，阳性细胞界限明显。由于免疫阳性产物不表达于细胞核，故细胞核呈蓝黑色。表达阴性的淋巴细胞由于用苏木精复染而使细胞核呈蓝色，细胞质和细胞膜不着色。免疫组织化学结果的量化标准：应用Leica显微图像处理系统，QWin软件，确定视野中单位面积（88152.49µm2）内阳性细胞的多少，作为凋亡基因表达的量化指标。具体操作为：应用Leica显微处理系统，在10倍（目镜）×20倍（物镜）即×200显微镜下采集图像，QWin软件计数每个视野电脑显示屏显示框内阳性细胞的个数（该显示框显示实际切片视野面积为88152.49µm2）。例如：每一试验组5羽，每羽每个免疫器官随机选择1张切片，每张切片随机选择3个互不重叠的有阳性细胞的视野，计算每个免疫器官5张切片共15个视野内阳性细胞的平均值，即该免疫器官视野中单位面积（88152.49µm2）内阳性细胞的个数，以此作为该试验组凋亡基因表达的量化标准。2.1Fas在固始鸡免疫器官内的表达结果2.1.1Fas在固始鸡法氏囊内的表达结果（三级标题，五号楷体，正文不空行，但空一格）Fas蛋白表达于固始鸡法氏囊内不同部位的淋巴细胞，不表达于上皮细胞（见图版1，2）。阳性细胞分布于上皮层与淋巴小结之间靠近上皮层的固有膜区域、淋巴小结边缘、淋巴小结与淋巴小结之间固有膜区域，淋巴小结内部少量淋巴细胞也有Fas表达。阳性细胞呈簇团状分布，也呈散在分布（见图版1，2）。Fas在不同发育阶段固始鸡法氏囊内