菌种管理规程

菌种管理规程目的规范药品微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、验收、保存、传代、使用及销毁等。责任质量控制处主管：负责菌种的申购。微生物检验人员：负责菌种的验收、保存、传代、使用及销毁等。质量控制处经理：负责菌种申购计划的审核及日常督促检查。质量管理负责人：菌种申购计划的审核。制造中心总监：菌种申购计划的批准。相关术语标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。菌种的代是指将其接种至新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。相关文件无程序1菌种的申购质量控制处主管根据菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出申购计划，由质量控制处经理、质量管理部负责人审核，制造中心总监批准后，向中国药品生物制品检定所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）药检所购买传代用菌种。购买时，需询问和确定菌种的代数，以便传代时控制代数。同时在运输过程中注意严格按照保存条件要求进行。2菌种的验收菌种到达实验室后，由质量控制处微生物检验人员验收，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《菌种接收记录》上，内容包括：名称、数量、编号、代数、来源、接收日期、接收人等，新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2～8℃，有效期为3个月。新购进的菌种斜面应在一周内完成传代。3菌种的传代：菌种的传代因冻干菌（标准菌种）与传代用菌种而不完全相同。3.1标准菌种的复苏、确认、传代3.1.1标准菌种的复苏步骤如下：把冻干菌种管、灭菌毛细滴管（1ml）、双碟、镊子、营养肉汤培养基（或其它适宜培养基）数支，移入接种室或超净工作台。将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将标准菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌毛细滴管吸取营养肉汤培养基（或其它适宜的培养基），滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取营养肉汤培养基（或其它适宜的培养基）少许，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至营养肉汤培养基（或其它适宜的培养基）内，并根据不同菌种类型而将其培养于相宜的温度下24～72h（细菌需要24～48h的培养物，酵母菌需要72h的培养物，形成孢子的微生物则宜保藏孢子）。最后将毛细滴管及菌种管经高温灭菌（121℃，30分钟）。黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有0.05%（ml/ml）的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至100ml4.4.2项下液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。取出培养物，仔细观察液体培养基是否浑浊，浑浊说明菌种复活生长，若不浑浊，在将其作为无活菌生长的培养物丢弃以前，细菌应至少培养1周以上，真菌和酵母菌至少应培养2周以上，并在丢弃之前应高温灭活处理（121℃，30分钟）。3.1.2标准菌种的确认用无菌接种环取上述培养物接种到营养琼脂培养基（细菌）或玫瑰红钠培养基（真菌和酵母菌）平板上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板上，然后在30～35℃下培养1～3天（细菌）；23～28℃下培养5天（真菌和酵母菌）。培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，划线于平皿培养基，每种菌划4个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进行保存和鉴定。鉴定时作革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及形态特征。最后再做生化实验以进一步鉴定该菌种。若在该平板上发现有其它菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了的培养物灭活处理，并寻找原因。应根据其原因采取措施重新分离挑选纯菌落。上述操作完成后，需填写《菌种传代、分离、鉴定记录》。各菌种的复活、划线用培养基、培养条件，见《菌种复活、划线用培养基、培养条件》（附件2）。3.1.3标准菌种的传代和保藏按菌种说明书要求复溶菌粉，转种于适宜的增菌培养基内，称第1代（G1），复壮后转接至平板上，并在适当温度下培养适当时间，分离单个纯种菌落，此为第2代（G2）。菌种确认后，挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，作为传代用菌种（G2），同时挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种，此为第3代（W3）。将第2代（G2）菌种管冷冻保存，将工作用菌（W3）于适当温度下培养适当时间后用于日常检验。3.2传代用菌种的传代和保藏3.2.1当无标准用菌种时，可从省（市）药检所购买菌种作为传代用菌种，不需经过复溶增菌，但应划线接种确认。3.2.2将购回无异常的传代用菌种（一般为第3代），根据日常检验工作的需要量，挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种(为第4代)，同时，结合菌种的代数和最长保存期限，挑取纯菌落制成浓菌悬液制备甘油冷冻管或液体石蜡管数支，作为传代用菌种（仍为第3代）。3.2.3传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）：从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。将已接种好的细菌管置30～35℃细菌培养箱培养22～24h，真菌管置23～28℃真菌培养箱最多培养7天。按上述规程操作，直至G4转为W5为止，需重新开启冷冻干燥菌种，重复上述规程操作，保存和使用菌种。当工作用菌种代数小于5时，在规定保存期限内，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。3.3工作用菌种的传代:当工作用菌种代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。3.3.1取在冰箱4～8℃保存的工作用菌种用普通琼脂斜面传代，并将新传代的培养物替代原有的菌种，作为工作用菌种。3.3.2也可取用“甘油冷冻管保藏法或液体石蜡覆盖保藏法”保存的菌种，进行复苏，直接作为工作用菌种。3.4传代时注意无菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丢失。同时实验人员也要采取有效的预防措施进行自我保护，工作时必须穿工作服，佩带无菌手套，实验完成以后消毒实验进行的区域、实验仪器和器具等。如发生意外，如菌种泄漏或人员受伤，微生物学检验人员应立即向质量控制处主管报告以便及时进行处理。3.5传代后，按检定菌种的编号原则编号，并在每一支菌种管上贴上标签，标签内容包括：名称、编号、代数、传代日期、操作人、有效期。交微生物组主办统一保管。同时及时填写《菌种传代、分离、鉴定记录》。4.3各菌种的保存方法、条件及期限，见《传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限》。5菌种的编号采用字母加数字表示：英文缩写字母—代次—传代日期—顺序号菌种的英文缩写字母：大肠埃希菌（E.c）、金黄色葡萄球菌（S.a）、枯草芽孢杆菌（B.s）、白色念珠菌（C.a）、黑曲霉菌（A.n）、乙型副伤寒沙门菌（S.p）代数用一位带有下标数字的字母表示：传代用菌种用G表示；工作用菌种用W表示；如G3表示传代用菌种第3代；W3表示工作用菌种第3代。传代日期用6位数字表示：年份取最后两位数，月、日分别用两位数。如2012年01月12日传代的第一支大肠埃希菌作为传代用菌种的编号为：E.c-G3-120112-01。6菌种的保管6.1菌种设专人加双锁保管，并对所保存的菌种建立《菌种保存、领用、发放登记台账》。6.2菌种的定期检查与鉴定6.2.1在菌种的保存期间，应每天（工作日）检查保存菌种冰箱的温度、每周检查菌种管的塞子是否松动或生霉，并及时填写《检定菌种观察记录》，如有异常应及时处理。6.2.2菌种在保存期内均应根据菌种的特性（工作用菌种每转种两代一次、传代用菌种每三个月一次）检查其菌落性状、革兰染色、显微镜下菌体形态及生化特性等项目，若发现与原菌种变异较大，应重新分离、纯化、鉴定、再加以保存，并做好《检定菌种传代、分离、鉴定记录》。6.3所保管的菌种，不能随意转让其他单位和个人，需要时应有单位证明和批准手续方可供应。7菌种的领用与使用7.1微生物学检验人员根据检验需要，需到菌种保管人员处工作用菌种或传代用菌种，用于日常检验或验证试验，使用后及时填写《菌种使用登记表》和《菌保存、领用、发放登记台账》，以便追踪菌种使用历史。7.2冻干菌种管一旦解冻制备工作菌种后，不得重新冷冻和再次使用。8菌种（废弃）的销毁8.1下列情况的菌种或培养物或被污染的器具等，必须采用121℃、30分钟湿热灭活处理：新一代菌种制备成功后的上一代菌种；使用完后的菌种和带有标准菌种的器具和培养物；超过有效期的菌种；凡被污染、变异、可疑等异常情况菌种；其他应废弃的菌种。8.2废弃菌种的销毁由质量控制处微生物主办提出申请，交质量控制处主管批准后，由微生物检验人员进行灭活处理，填写《废弃菌种（物品）销毁处理记录》。