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第1页（共7页）木聚糖降解菌的筛选及分子鉴定作者：×××指导老师：×××摘要：从宝天曼地区采集的腐木中富集、分离出了16株能够降解木聚糖的菌株。利用刚果红活性染色法对菌株进行染色，根据透明圈的大小筛选出6株产木聚糖酶菌株。6株菌株在摇床180r/min、28℃的条件下发酵培养48h，利用DNS法测定各菌株木聚糖酶的活力大小，结果表明菌株M3的酶活力最高，酶活力为19.098U/mL。提取菌株M3的基因组进行26SrDNAPCR扩增并进行序列测定，经相似性分析和系统发育树分析，初步鉴定菌株M3属于Trichosporonporosum。关键词：木聚糖降解菌；筛选；分子鉴定；木聚糖酶；酶活0引言纤维素类物质是一类大量存在而又可再生的重要潜在资源，半纤维素占总纤维素的15%~30%，其中主要成分是木聚糖。与纤维素相比，半纤维素更易为微生物所降解和转化[1]。木聚糖酶是一类以内切方式降解木聚糖分子中β-1,4-木糖苷键的酶类，其水解产物主要是木二糖和木寡糖，也有少量木糖和阿拉伯糖。该酶具有广泛的应用前景[2]，该酶在造纸业中部分替代二氧氯用于纸浆漂白，可改善纸浆性能；木聚糖酶作为饲料添加剂，可提高饲料的能量值和禽、畜对饲料的利用率；食品工业中可利用木聚糖酶降解半纤维素的主要成分木聚糖生产低聚木糖等高附加值的产品。可见木聚糖酶在工业中的用途非常广泛。因此国内外很多研究者都致力于对木聚糖酶的研究，已有不少研究者对黑曲霉、木霉(Trichodermasp.)等真菌及短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、环状芽孢杆菌(B.circulans)等细菌的木聚糖酶进行了研究。森林腐木中富含半纤维素，这种环境中有大量的微生物都能分解木聚糖，从中很容易筛选得到高效降解木聚糖的菌株。本研究主要从宝天曼森林腐木中富集、分离、筛选出产木聚糖酶菌株，并分析它们木聚糖酶的酶活力大小，找出酶活力较高的分离菌株。最后通过分子生物学方法测定分离菌株的26SrDNA序列并对其进行序列相似性分析和系统发育树分析，初标题小2号黑体、居中。应简练，一般不超过25个汉字。小4号仿宋体、居中，作者在上、指导教师在下；作者与标题、指导教师与摘要之间空小四单倍行距。“摘要”、“关键词”字体为小四黑体。摘要内容与正文左右缩进2字符，小4号仿宋体，两端对齐方式排列，首行缩进2字符，行距20磅。不能用第一、第三人称，不得出现评价性语言。词与词之间用分号。一般为3～5个，尽量不与标题重复。正文与关键词之间空小4单倍行距一行。正文文字用四号宋体、22磅行距、全角标点上标格式按出现的先后顺序标序；连续文献如[2-6]，不连续文献如[1,4,7]来表示。种名用斜体英文缩写首次出现，应标出英文全称。第2页（共7页）步鉴定出分离菌株在系统发育上的分类地位。1材料与方法1.1样品取自实验室保存的宝天曼地区采集的腐木。1.2试剂2.2%溴钾酚绿、1%刚果红溶液、1mol/LNaCl溶液、柠檬酸缓冲液、木糖溶液、DNS试剂、试剂酵母基因组提取试剂盒、PCRMagicMix2.0、引物NL1、引物NL4、TAE缓冲液、琼脂糖凝胶、EB试剂。1.3培养基[3]富集培养基：木聚糖1%、酵母氮基础培养基1%、氯霉素(80μL/100mL)；分离培养基：酵母提取物0.5%、葡萄糖1%、溴钾酚绿2%、琼脂2%、氯霉素（80μL/100mL）；鉴别培养基：木聚糖1%、酵母氮基础培养基1%、琼脂2%、氯霉素（80μL/100mL）；斜面培养基：酵母粉0.3%、麦芽粉0.3%、蛋白胨0.5%、琼脂2%、氯霉素（80μL/100mL）；1.4菌株筛选[4,5]1.4.1富集培养取7支干净小试管，向每支试管中分装入3～5mL富集培养基，于121℃高压灭菌锅中灭菌20min。用镊子夹取少许实验室保存的7种森林腐木分别放入已灭菌的富集培养基中，于28℃温箱中富集培养2～3d。1.4.2平板分离对培养后变混浊的富集培养液按照梯度稀释法用无菌水稀释到10-5，在超净工作台中的无菌条件下，准确吸取100μL的10-3～10-5不同稀释倍数的菌液涂布于已灭菌的平板培养基上，于28℃温箱中倒置培养2～3d。1.4.3纯化菌种根据菌落形态特征的比对，找出不同形态的菌株。在无菌条件下，挑取不同形态的单菌落在已灭菌的纯化培养基上进行扇形划线，于28℃温箱中倒置培养2～3d。按照同样的方法划线2～3次后即可得到纯菌落。用镊子夹取已灭菌的牙签，将纯化培养基中的纯菌落点蘸到鉴别培养一级标题用阿拉伯数字、小3号黑体、左顶格，不加标点，段前、段后各空四号单倍行距一行。一级标题不可置于页尾。序号与标题文字之间空一字之距。二级标题采用阿拉伯数字1.1、1.2等格式标引、4号黑体、左顶格、不加标点。序号与标题文字之间空一字之距。三级标题采用阿拉伯数字1.2.1等格式标引，4号宋体、左顶格、不加标点，序号与标题文字之间空一字之距。数值与单位之间空半字之距。英文、数字、符合等用TimeNewRome字体。第3页（共7页）基上，于28℃温箱中倒置培养2～3d。待菌落长大后用1%刚果红进行活性染色30min，倾去染液，再用1mol/LNaCl溶液漂洗1h，观察菌落周围是否有透明圈出现以及透明圈的大小。出现透明圈的菌落即为所需要的木聚糖降解菌，再选出透明圈大且明显的菌株接种到斜面培养基上于4℃冰箱中保存备用。1.5木聚糖酶活力的测定1.5.1木糖标准曲线的制备取烘干好的木糖0.1000g溶解于蒸馏水中后，再用100mL容量瓶定容至100mL，得到1mg/mL的木糖溶液。用木糖制备标准曲线的体系见表1。表1制备木糖标准曲线的溶液体系（单位：mL）编号0123456木糖标准液蒸馏水DNS02.01.50.21.81.50.41.61.50.61.41.50.81.21.51.01.01.51.20.81.5注：表中所用试剂为纯试剂取7支带刻度的平底试管，编号为1～7，分别加入上述溶液。于沸水浴中煮沸5min后，立即放入冷水中冷却，加蒸馏水定容至25mL，用TU-1901双光束紫外可见分光光度计在540nm波长下测OD值并制作工作曲线备用。1.5.2摇瓶培养取一环旺盛生长于斜面培养基上的菌种接种到已灭菌的种子培养基中，28℃、180r/min进行三角瓶摇床培养24h，取2mL菌液加入已灭菌的发酵培养基中28℃，180r/min摇床培养48h。1.5.3木聚糖酶粗酶液的制备取5mL发酵培养基菌液于已灭菌的10mL离心管中，在4℃离心机中6000rpm离心20min，转移上清至另一离心管，则为所需的粗酶液。取各酶液1mL装入1.5mL离心管中沸水浴煮沸10min得到失活酶液作为空白对照。1.5.4木聚糖酶酶活力的测定[6]取25mL具盖带刻度的平底试管，加入1.5mL1%木聚糖柠檬酸缓冲液于50℃水浴预热15min，再加入0.5mL相应酶液(对照中加入0.5mL灭活酶液)，50℃水浴保温30min(隔几分钟震荡数次)。然后加入1.5mL的DNS试表包括表序、表题、表格、表注等。表与上下文之间空小四、单倍行距，标题在表上、小四宋体，表序与标题间空一字之距；表格为“三线表”格式（自动套用格式--简明型1），首、尾线为粗线，表内文字为5号宋体。表注在表格下方，5号仿宋字，与正文左右缩进2字符。第4页（共7页）剂，沸水浴煮沸5min，立即放入冷水中冷却，并定容至25mL。………。1.6菌株的分子鉴定1.6.1基因组DNA的提取菌株基因组DNA的提取采用酵母菌基因组提取试剂盒法。用接种环从斜面培养基上取三环生长旺盛的酵母菌细胞，悬浮于500μL无菌水中，12000rpm离心1min，弃上清，沉淀即为各菌株的菌体。按照酵母菌基因组提取试剂盒中使用说明书上的流程进行各菌株基因组的提取，并将其保存于TE缓冲液中，放入4℃冰箱中保存备用。将各菌株基因组进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据条带的亮度确定基因组的稀释倍数，作为PCR扩增的模板。………2结果与分析2.1菌株筛选用木聚糖作为唯一碳源从实验室保存的腐木中分离能产木聚糖酶的菌种。………2.2基因组DNA的提取和PCR的扩增以NL1和NL4作为引物对菌株M3的26SrDNA基因组做特异性PCR反应扩增。将扩增的基因组进行琼脂糖凝胶电泳分析得到单一条带，片段大小长度约为600bp，扩增产物无明显非特异扩增现象，结果见图1。图1菌株M326SrDNA电泳图注：1、DL2000marker；2、菌株M3750bp500bp12图包括图形、图序、图题、图注。图题在图下、小4号宋字、加粗，图序与图题间空一字之距；图注在图题下方、5号仿宋字，与正文左右缩进2字符；图形中应对与文中相关的信息标注。版面尺寸：A4（210毫米×297毫米）。正文位置：上、下边界25毫米、左边界30毫米、右边界20毫米、装订线位置定义为0毫米。第5页（共7页）2.326SrDNA序列相似性分析测定菌株M3的26SrDNA序列，长度为595bp，将获得的26SrDNA碱基序列经DANMAN软件处理后在GenBank核酸序列数据库中通过BLAST进行同源序列搜索及相关信息检索，得到菌株M3的26SrDNA序列与其他菌种的相似性，结果见表2。检索结果表明，菌株M3与Trichosporon的26SrDNA序列有较高的相似性。……………3讨论木聚糖作为植物半纤维素的重要组分，是自然界继纤维素之后含量第二丰富的可更新的多糖。以往的研究中，半纤维素的再利用通常经过酸水解处理，而后再经微生物转化为生产产品。然而，尽管酸水解速度快，但伴随有毒性化合物产生，对随后的生物转化过程有影响。因自然界中许多微生物类群都能产生木聚糖酶，且微生物木聚糖酶水解法处理半纤维素更为安全和有效，因而大力开发经济、高效的微生物木聚糖酶具有重要意义。以往研究的木聚糖降解菌主要集中在霉菌、放线菌等，而霉菌、放线菌等生产木聚糖酶周期相对较长，通常为4～7d。少数产木聚糖酶细菌的产酶效率相对较低。本研究以木聚糖作为唯一碳源从森林腐木中分离、筛选出6株木聚糖降解菌。利用刚果红活性染色法对各菌株染色，根据透明圈的大小初步判定M3降解木聚糖的能力较强。进一步对各菌株进行酶活力测定，结果表明菌株M3在摇床180r/min，28℃，48h条件下利用1%木糖的酶活力最高，酶活力为19.098U/mL。M3产酶效率高，发酵周期短，仅48h。通过26SrDNA序列相似性分析得出，菌株M3与Trichosporonporosum亲缘关系较近，其中与Trichosporonporosum的相似性为100%，因此初步鉴定菌株M3属于Trichosporonporosum。用分子生物学的方法对酵母菌进行分子鉴定，是一种快速、简便和有效的方法。利用26SrDNA序列分析方法对酵母菌进行分离和分子鉴定，为研究酵母菌打下了基础。页码采用小4号宋体，用“第×页（共×页）”的格式，居中，距下边界15毫米的位置。第6页（共7页）参考文献[1]周世宁,陆勇军,杜扬.木聚糖降解菌的筛选和木聚糖酶性质的研究[J].中山大学学报,1996,35(1):91-96.[2]黄云红,等.木聚糖酶高产微生物的筛选和鉴定[J].江西师范大学学报,2002,26(3):245-248.[3]王辰,白逢彦.海南热带雨林腐木上酵母菌物种多样性研究[J].菌物学报,2009,28(3):354-362.[4]国春艳.酸性木聚糖酶产生菌的筛选及酶学性质分析[J].中国农业科学,2010,43(7):1524-1530.[5]孙丰慧,李安明.耐碱性木聚糖酶产生菌的筛选及发酵条件研究[J].应用与环境生物学报,2008,14(3),436-439.[6]濮智颖.酸性木聚糖酶产生菌产酶条件及酶学性质研究[J].陕西教育学院学报,2008,24(2):101-105.[7]陈红歌.酸性木聚糖酶产生菌的筛选及产酶条件[J].微生物学报,1999,39(4):350-354.[8]AnthonyT,GunasekaranP,RajKC,RajendranA,GunasekaranP.I