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1蝗虫精细胞减数分裂观察实验目的：通过对雄蝗虫精原细胞减数分裂装片的观察，初步学会识别减数分裂某些阶段染色体的形态和数量等的变化，加深对减数分裂过程的理解。实验原理：减数分裂是有丝分裂的一种特殊方式。减数分裂（Meiosis）的特点是DNA复制一次，而细胞连续分裂两次，形成单倍体的精子和卵子，通过受精作用又恢复二倍体，减数分裂过程中同源染色体间发生交换，使配子的遗传多样化，增加了后代的适应性，因此减数分裂不仅是保证生物种染色体数目稳定的机制，同且也是物种适应环境变化不断进化的机制。减数分裂由紧密连接的两次分裂构成。通常减数分裂I分离的是同源染色体，所以称为异型分裂（heterotypicdivision）或减数分裂（reductionaldivision）。减数分裂II分离的是姐妹染色体，类似于有丝分裂，所以称为同型分裂（homotypicdivision）或均等分裂（equationaldivision）。和有丝分裂一样为了描述方便将减数分裂分为几个期和亚期。一减数第一次分裂――减数分裂期I1前期I前期I持续时间最长，达几周，几个月甚至几十年，它的变化最复杂，可呈现出不同形态特征。1)细线期(凝集期)①染色质凝集；②染色体呈单条细线，细线两端与核膜相联；③染色体纤维上出现染色粒。2)偶线期(配对期)同源染色体配对，即1条来自父方1条来自母方的一对同源染色体相互靠近，结合在一起。3)粗线期(重组期)①染色体明显变粗变短，紧密结合；②同源染色体间发生DNA片段的交换和重组；③合成DNA及组蛋白，有些DNA减数分裂期专有的组蛋白在粗线期合成。4)双线期(合成期)①同源染色体分离但留交叉；②染色体部分去凝集，RNA转录活跃；③核仁明显变大。5)终变期(再凝集期)①染色体重新凝集呈短棒状，此时观察染色体最容易；②核仁消失；③染色体四分体端部交叉结合在一起；④姐妹染色单体借着丝粒相连。随后核膜破裂，标志着中期I的开始。2细线期偶线期粗线期双线期终变期2中期I①核膜破裂，纺锤体形成，②染色体四分体排到在赤道板上，排列后开始分离。3后期I同源染色体对相互分离，移向两极。4末期I及间期时间短，间期没有DNA复制。末期I及间期细胞的变化有两种类型:①没有可见的染色体去凝集，立即准备二次分裂。②染色体去凝集形成染色质，核膜出现，胞质分裂，形成两个间期的子细胞，经短暂间隔后，细胞开始进行减数分裂第二次。中期I后期I二减数第二次分裂――减数分裂期Ⅱ减数第二次分裂过程与有丝分裂基本相同，分为前，中，后，未各时期。3这次分裂实际上是一次有丝分裂。其过程简单，二条姐妹染色体分开，变成单倍染色体。前期II中期II后期II末期II实验材料及用品：蝗虫，载玻片，盖玻片，剪刀，镊子，解剖针，表面皿，显微镜。醋酸胭脂红染液实验步骤：取活雄性蝗虫1头，剪去翅和足，从蝗虫腹部剖开，靠近胸节处有桔黄色团状结构，为精巢。用蒸馏水冲洗可见每条精细小管的一端连于输精管，另一端为分散的盲端。取一个或两个精细小管放于载玻片上，用刀片在精细小管上横切两到三次。以醋酸胭脂红染液染色10－15分钟，同时以小镊子轻轻挤压精细小管外壁，以使性母细胞或减数分裂中各时期的细胞流出精细小管管壁，以利于观察，压片后进行观察，可以见到减数分裂的各个时期。附：减数分裂与有丝分裂的比较减数分裂与有丝分裂的共同点都是通过纺锤体同染色体的相互作用进行细胞的分裂。但二者之间有许多差异∶①有丝分裂是体细胞的分裂方式，减数分裂主要是细胞产生配子的过程(生殖细胞也有有丝分裂)。②有丝分裂是一次细胞周期,DNA复制一次,分裂一次,染色体由2n→2n;减数分裂是两次细胞周期,DNA复制一次,细胞分裂两次,染色体由2n→1n。4③有丝分裂中,每个染色体是独立活动;在减数分裂中,染色体要配对、联会、交换和交叉。④有丝分裂之前,经DNA合成,进入G2期后才进行有丝分裂;减数分裂之前,DNA合成时间很长(99.7%合成,0.3%未合成),一旦合成,即进入减数分裂期,G2期短或没有。⑤有丝分裂时间短,1-2小时;减数分裂时间长,几十小时至几年。有丝分裂与减数分裂的比较5果蝇性状观察、饲养及杂交试验1.实验目的学习黑腹果蝇（普通果蝇）的性状观察和饲养技术。认识果蝇的外形特征，掌握各种常见表型变异的识别和雌雄鉴别，了解果蝇生活史及其生活习性，掌握果蝇的饲养技术。掌握果蝇幼虫唾液腺的剖离技术和玻片的标本制备的方法，观察果蝇唾液腺染色体的带型特征，为染色体畸变研究打下基础；通过果蝇杂交试验的设计和实践，培养学生的分析思考和创新能力，加深学生对X2测验和遗传学基本规律的理解。2.实验原理普通果蝇（Drosophilamelanogaster）是双翅目的昆虫，它的生活史从受精卵开始，经历幼虫、蛹和成虫阶段，因此是一个完全变态的过程。果蝇中有许多突变类型，据不完全统计突变性状有四百多种，这些突变型大多属于形态突变，如白眼、残翅、黄体等，因此很容易进行观察。果蝇体型小，在培养瓶内易于人工饲养。而其繁殖力很强，在适宜的温度和营养条件下每只受精的雌蝇可产卵400个左右，每2个星期就可完成1个世代，因此在短时间内就可以获得大量的子代。此外，由于果蝇染色体少，只有8条，且唾液腺存在着体形巨大的多线染色体，显带清晰，是染色体畸变研究的良好材料；培养过程中易发生自发突变，可积累大量变种，且性状大多数是形态突变，容易观察，使其成为生物学研究中的模式生物，得到广泛而深入的研究。3.实验用具及材料解剖镜、麻醉瓶、毛笔、白瓷板、普通果蝇野生型及不同突变型果蝇、乙醚、玉米粉、糖、酵母粉、琼脂等。4.实验方法及步骤1）普通果蝇的生活史及形态观察（1）生活史观察①卵成熟的雌蝇交尾后（2～3d）将卵产在培养基的表层。②幼虫果蝇的受精卵经过一天的发育即可孵化为幼儿虫。果蝇的幼虫从一龄幼虫开始经两次蜕皮，形成二龄和三龄幼虫，随着发育而不断长大，三龄幼虫往往爬到瓶壁上来化蛹，其长度可达4～5mm。幼虫一端稍尖为头部，黑点处为口器。③蛹幼虫经过4～5d的发育开始化蛹。一般附着在瓶壁上，颜色淡黄。随着发育的继续，蛹的颜色逐渐加深，最后为深褐色。在瓶壁上看到的几乎透明的蛹是已经羽化完而遗留的蛹的空壳。6④成虫刚羽化出的果蝇虫体较长，翅膀也没有完全展开，体表未完全几丁质化所以成半透明透乳白色。随着发育，身体颜色加深，体表完全几丁质化。羽化出的果蝇在8～12h后开始交配，成体果蝇在25℃条件下的寿命为37d。果蝇生活史2）雌雄鉴别为了准确地配制果蝇的杂交组合和果蝇遗传性状分析，必须首先能够正确辨别果蝇的性别。①麻醉对果蝇实施麻醉是为了便于性状观察和转移果蝇，因此麻醉时一定要根据实验目的的而确定麻醉的深度。如果只是进行观察，可以将果蝇麻醉至死。死亡时表现为翅膀与身体呈45度角。但如果是麻醉鉴别后再进行转移培养，就应避免麻醉至死。麻醉时，在麻醉瓶的瓶塞滴加乙醚，待乙醚气体在瓶内充满后将果蝇培养瓶的瓶口与麻醉瓶口对准，将果蝇转入麻醉瓶内，盖好瓶盖。观察果蝇的表现，若果蝇从瓶壁上纷纷落到瓶底，表示麻醉已生效。转移麻醉后的果蝇时，应用毛笔的笔尖粘取。②将麻醉后的果蝇放在解剖镜下仔细观察，区别雌雄的差异。在雌雄差异中，以性梳的差异最为准确。如刚羽化出的果蝇，身体都较长，颜色很浅。但是，用性梳的有无就可以很快将雌雄分开，在熟练操作几次后，就可以不必借助解剖镜而用肉眼或放大镜就能很快区分雌雄。雌雄果蝇主要差异比较：雌果蝇雄果蝇肉眼或放大镜观察体型较大体型较小腹片6片腹片4片腹部椭圆形末端稍尖腹部末端钝圆腹部背面5条黑纹腹部背面3条黑纹，最后一条延伸至腹面成一黑斑解剖镜观察无性梳第一对足第一跗节有性梳7雌果蝇腹片雄果蝇腹片雄性果蝇第一对足第一跗节性梳3)突变型观察与野生型果蝇作对照，观察突变型果蝇的性状表现，如残翅、黑身、白眼等。4）配制培养基培养果蝇用的容器可以采用广口瓶，这些容器均需在实验前进行高温灭菌才能使用。可以按如下成分进行培养基的配制：玉米粉100g糖100g琼脂4g酵母粉适量水1000ml丙酸7ml将上述成分（除酵母和丙酸）放在一烧杯内混合在一起，在电炉上加热，不断用玻璃棒搅拌以免将玉米粉煮糊。煮沸后将烧杯从电炉上取下，稍放置冷却一会儿，加入丙酸，用玻璃棒搅拌均匀后分装到40个经高温灭菌的培养瓶内，塞好棉塞，加入适量的酵母粉备用。注意在分装时不要把培养基倒在瓶壁上。刚配制完的培养基放凉后在瓶壁上会有许多水滴，这时如果把果蝇放进去，水滴可能将果蝇的翅膀粘住，为避免发生此事，可将配好的培养基放在温箱内2～3d，待水分蒸发后再使用，或用酒精棉将瓶壁上的水分擦掉。5）果蝇唾液腺巨染色体观察果蝇的体细胞中有4对染色体。果蝇（三龄）幼虫唾腺染色体比正常的处于有丝分裂期的染色体大得多，因而又称为巨大染色体。巨大染色体上有许多横纹，这些模纹的数目和位置是相对恒定的。由于果蝇唾腺细胞中的同源染色体两两配8对时总是紧密结合在一起，当其中一条染色体发生结构变异时，就很容易被识别出来。果蝇唾腺巨大染色体是由于重复分裂后的众多染色线没有分开的结果，一条染色体内含有染色体线多达千条以上。一般来说，多线染色体是处于永久性前期中的一种体细胞染色体配对形式。它普遍存在于双翅目昆虫某些物种的幼虫唾腺细胞内，是研究唾线染色体常用的材料。（1）、幼虫的解剖将载玻片置于解剖镜，滴上一滴生理盐水。将幼虫置于生理盐水内，一手持解剖针按住幼虫末端的1/3处，以固定幼虫。另一手持针揿住幼虫头部正中，用力向前拉，把头部从身体拉开，腺体即随之而出。唾腺为半透明的小囊状，其上附有白色的脂肪带，食道两侧各有一个。找到唾腺后尽可能把腺体上的脂肪剔除。果蝇唾液腺（2）、染色滴上几滴醋酸胭脂红于唾腺上，染色8—12分钟。（3）、压片在载片上加盖玻片，盖片上覆盖一吸水纸，然后以母指适当用力压片，要求将唾腺细胞核压破，染色体伸展开来而不破碎为好。(4)、显微镜下观察压好的玻片标本，用显微镜观察。果蝇唾液腺染色体6）选处女蝇用于杂交的亲本雌蝇应该是没有交尾的处女蝇，这样才能保证杂交结果按照实验者所设计的路线进行。那么如何才能得到处女蝇呢？一般来说，刚羽化出来的果蝇在12h之内是不进行交配的，所以在这段时间内选出的雌蝇即为处女蝇。为了保险起见，可以在羽化后的8h内对新羽化出的果蝇进行挑选。7）配制杂交组合9按照所设计的杂交组合，如白眼♀×红眼♂选出白眼处女雌蝇5～7只，红眼雄蝇5～7只共同放入一个培养瓶内。在培养瓶上贴好标签，注明杂交内容、日期、实验组号等，然后将培养瓶放入25℃的培养箱内进行培养。8）当发现培养瓶内有蛹出现后应及时将亲本处死以防发生回交当有F1个体现后，观察其表型，注意显、隐性关系并计数统计7天。在一个新的培养瓶内放入5对F1配成F1×F1，此时不需要选处女蝇。当看到培养瓶内有蛹出现时，将亲本处死。F2果蝇出现后，进行观察统计7天，观测数目在100只以上。按照所配制的杂交组合，提出理论假设并根据实验结果进行X2检验。注意：无论是对F1还是对F2进行统计，都要及时进行，避免陆续羽化出的果蝇在培养瓶内交尾后将卵产在培养基内。因此要求实验者不断进行观察，只要有新羽化出的果蝇就要及时取出并进行统计和观察。