葡萄中白藜芦醇的含量及功能研究

葡萄中白藜芦醇的含量及功能研究摘要：白藜芦醇在人体中有降血脂、防血栓、抗癌、抗氧化、抗菌和预防老年痴呆等多种生理功能。在植物中也是一种抗毒素。本文总结了葡萄不同品种及部位白藜芦醇的含量差异，并对影响白藜芦醇含量的影响因素进行了总结。关键词：葡萄白藜芦醇生理功能含量差异影响因素白藜芦醇化学名称为芪三酚（Resveratrol，3,4',5-三羟基二苯乙烯），是植物界分布较广的羟基二苯乙烯芪类化合物，属于二苯乙烯衍生物。白藜芦醇有顺式和反式两种异构体。自然界中的白藜芦醇以游离态和化合态两种形式存在，化合态以糖苷和低聚物的形式存在，故白藜芦醇一般有4种存在形式：顺、反式白藜芦醇和顺、反式白藜芦醇糖苷。1Res对人类疾病的药理作用流行病学调查发现，长期适量饮用红葡萄酒能够降低心血管疾病的发病率和死亡率，其中的Res是主要的活性物质，并发挥了重要作用。近年来，国内外越来越多的研究表明，Res具有多种生物学效用。Res能与人体内雌性激素受体结合，调节血液中胆固醇水平，有效减少人罹患心血管病的危险[2]；Res还能抑制低密度脂蛋白过氧化和血小板凝集，调节脂类蛋白代谢水平，降低人体血脂，具有良好预防动脉粥样硬化和冠心病效果[3-4]。Res还具有强抗氧化和抗自由基功能，1.3μg/mL的白藜芦醇能明显抑制大鼠红细胞的自氧化溶血和由H2O2引起的氧化溶血，并对小鼠心、肝、脑、肾的体内外过氧化脂质的产生有明显抑制作用[6]。Res具有抗突变以及抗癌作用，能抑制环加氧酶和过氧化氢酶的活性，在癌细胞的起始、增殖、发展3个主要阶段均有抑制乃至逆转作用[7]；Res可使老鼠皮肤癌细胞最多可减少98%[8]，能诱导人早幼粒细胞性白血病细胞株HL-60的分化[9]，被喻为继紫杉醇之后的又一新的绿色抗癌药物。Res具有明显的辐射保护作用[10]，并影响骨骼代谢[11]等。Res衍生物piceatannol具有和Res相同的抗癌[12]、免疫调节、抗菌、抗脂质氧化和抗癌细胞增殖的活成绩性[13]。此外，Res及其衍生物在肝脏保护、激活长寿基因、防治神经性疾病等方面也起着重要作用[14]。因此，Res广泛应用于医药、保健品、化妆品和食品添加剂等领域。2葡萄Res对植物病害的抵抗作用Res作为葡萄属植物的一种抗毒素被发现后，引起了科学家的高度重视。Langcake[15]等首次在葡萄叶片中发现Res，并能抵抗灰霉病（Botrytiscinerea）的侵染。Pont[16]等认为白黎芦醇抗灰霉病的活性与其亲脂性大小、分子体积及电子特性相关，并破坏细胞膜的结构，影响电子的有效传递。Hain[17]等将分离出的葡萄茎STS基因转到烟草中，结果发现这些烟草在受到病原菌感染时，感染部位有大量Res的积累，并且其合成Res能力与烟草抗灰霉病的能力呈正相关。郜海燕[11]等研究发现，葡萄在遭到霜霉菌（Plasmoparaviticola）侵染后，在没有被侵染且离坏死果实较近的部位其白藜芦醇的含量较高，说明Res作为植物抗毒素可以有效地抑制坏死区的扩展。Dercks[18]等发现了17个葡萄品种对霜霉病的抗性与紫外线诱导产生Res的能力正相关。John[19]等研究发现，Res与抗真菌能力相关。从野生葡萄中提取的Res对金黄色葡萄球菌（Slaphylococcusaureus）、耻垢分支杆菌（Mycobaeteriamsmegmatis）、表皮葡萄球菌（S.epidermidis）有较强的抑制作用，且大量报道葡萄中Res含量的高低与抗真菌能力有关[20]。Schnee[21]比较研究了不同葡萄品种对白粉菌（Erysiphenecator）的抗性，发现敏感品种感染病菌后产生的大量Res迅速糖基化为较小毒性的白藜芦醇苷（piceid，PD），而抗性品种感染病菌后产生的大量Res则迅速氧化为更高毒性的白藜芦醇聚合体（viniferins）。3葡萄Res含量研究葡萄不同品种间Res含量不同。国内外大量学者对葡萄组织中Res含量进行研究，结果发现葡萄各品种间Res含量存在较大差异。葡萄Res含量可能与生长环境、果实性状、用途等相关联，研究发现有核品种Res含量显著高于无核品种。李婷[22]等用HPLC法测定14个葡萄品种Res含量，结果表明：酿酒葡萄中的Res含量明显高于鲜食葡萄，供试葡萄品种中以黑比诺的Res含量相对较高。Li[23]等从种质资源水平上评价葡萄Res含量，结果发现种间杂交的砧木品种果皮和种子的Res含量显著高于其他栽培品种（美洲种＞欧亚种）。葡萄不同器官间Res含量也存在着显著差异。在正常生长状况下，葡萄果皮、种子含有较高的Res，果肉中很少，叶是检测Res最主要的器官，花和芽合成Res能力很低。谢红旗[24]等测定葡萄的生长器官的Res含量，结果表明：主藤＞侧藤＞支藤＞根＞叶片≈叶柄；各部位白藜芦醇在生长期含量变化趋势是先升后降，变化趋势较小。陈雷[25等对葡萄果肉、叶柄、种子、叶片、果皮及穗轴的检测发现，果穗轴和果皮中的Res含量较高，叶片和种子中的含量相对较低，果肉部分最低，而李婷[26]等研究发现：Res含量为果梗、叶片＞果皮＞种子＞叶柄。赵权[27]等对山葡萄叶、茎、卷须、果实检测发现，卷须＞茎＞种子＞果皮果肉。叶中白藜芦醇含量最高，达20.12μg/g。邓建平等研究了成熟度与Res含量之间的关系，结果表明成熟果皮＞成熟叶＞茎段；成熟果皮＞嫩果皮；成熟叶＞老叶＞嫩叶。萄植植株某些器官之间Res含量存在着一定的相关性，研究结果表明：葡萄浆果中Res的含量与叶子中的含量呈正相关[28]。4葡萄中Res含量的影响因素4.1影响葡萄中Res含量的内在因素Res是植物在受到病原形进攻和在环境恶化时产生的一种植物抗毒素[29]。真菌细胞壁碎片常被用在刺激葡萄发生灰霉病感染的某些过程，例如通过酸的水解作用，葡萄属植物细胞从真菌细胞壁中可得到葡聚糖激发子、可溶性碎片、可溶性片段可阻断常规蛋白的合成，而启动一小部分与诱导抗性有关的蛋白的合成，经过诱导被强化的葡萄属植物细胞在葡聚糖激发子、可溶性碎片共同作用下产生Res及其衍生物[30]，末尾阶段是Res合成酶（简称RS）将一分子的对香豆酰辅酶A（P-coumarogl)）和三分子的丙二酰辅酶A（malonyl-CoA），经苯丙氨酸聚丙二酸盐路径，转化为几种Res[31]。在Res的生物合成过程中有5种酶已被发现：合酶（简称STS），是人们研究最透彻的一种酶，STS的合成在整个Res的合成过程中速度是最快的，从空间角度来说，STS呈现微观的不均一性，是带一个亚基的二聚体，分子量为43000，等电点RI=5.4[32]。进一步研究发现它是负责酚类形成及Res合成的，整段的STS的cDNA是从葡萄属植物的mRNA序列开始的，含有39种氨基酸的片段，用PSV25作载体片段再分别插入到载体PKK233-2和PDS12/RBSH-2所得到的cDNA基因库在大肠杆菌中的表达产生了一个单独展示STS活性的二聚体[33-34]。通过对臭氧在欧亚种葡萄品种上诱导STS转录表达的研究（此研究是通过溶合TST启动子与β-葡萄糖苷酸酶（GUS）报告基因，再转化到烟草上），发现0.1mg/L臭氧处理10h可以使GUS基因表达提高11倍，GUS基因活性组织化学定位发现其活性表达呈斑点状分布于整个叶片。叶片的横切面组织化学定位表明STS的启动子（Vst1）在栅栏组织、海绵薄壁组织中被诱导，表皮组织细胞中表达较少。5＇端缺失表明部分启动序列在-430和-280处构建臭氧反应作用区，有效病原菌灰霉病诱导应从-280到-140[35]。Reniero等[36]从葡萄栽培品种霞多丽（Chardor-nay）的根中分离到Res的二聚体。Pool[37]等测试了15种葡萄成熟节间的木质部，发现其Res的含量不同。叶是检测Res使用最多、最方便的器官。芽和花合成Res的能力较低。果皮、果穗轴中含有较高的Res，尤其是果穗轴中，含量更可观，可达81.37mg·g-1[38]，是人类未来从饮食中摄取Res的主要源泉。青铜色和黑色果皮的圆叶葡萄，种子和果实与其它部分相比，Res的含量约占总量的23.4~30.1%。果实的果肉部分Res的含量很低，有些品种根本就不含Res[39-40]。葡萄植株某些器官之间Res含量存在着一定的相关性。研究结果表明：葡萄浆果中Res的含量与叶子中的含量呈正相关[41]。葡萄植物仅在适当的时期才合成Res，并且能合成的时期较短暂。Res无论是否产生抗病作用，其含量都将呈下降趋势[42]。Dercks等[43]调查了对霜霉病呈抗性、中抗、感病3个类型的不同品种，认为抗病品种卡斯特在霜霉病发病期可以一直保持较高的水平；抗病中等的Rupestris6544接种病菌后的最初几个小时积累一定量的Res，但积累水平很快下降；感病品种雷斯令一直呈下降趋势。Res的明显动态变化期出现在果实成熟期，其含量下降很快[44-45]。Jeandet[46]调查了葡萄栽培品种黑比诺（Pinotnoir），认为Res的含量是易变的。黑比诺与美洲葡萄（labrusca）浆果的Res含量在着色期后一直下降，黑比诺最后几乎接近于零。Res在果皮中的含量与果实成熟过程中糖的含量呈负相关[47]。Jeandet等[48]的研究认为，Res在果实成熟期骤然下降，这种源于葡萄不同生长期和花青素苷的消长关系，Res的前体为苯基苯乙烯酮，而此物的合成需要一种酶，这种酶又是花青素苷合成的关键酶，两种合成相抗争的结果，出现了Res合成能力的下降伴随着一系列花青素苷物质的升高。4.2影响葡萄中Res的外在因素4.2.1紫外线（UV）紫外线照射是Res产生的必要外部因素之一。紫外线最高峰值为260~270nm时可有效诱导Res的产生。用通量率为1W/m2的UV（270nm）照射10min，4h后Res的合成酶活性达到最大，在低通量率照射下，合成酶达到最大活性时所需时间加长[49]，254nm以下的UV对Res有破坏作用。在照以高强度的UV时，溶于乙醇中的tras-Res能转变为cis-Res[50]。4.2.2温度、湿度生长在湿热条件下的葡萄比生长在气候寒冷、干燥条件下的葡萄，由于病害侵染的压力较大，果实中所含的Res也较高[51]。4.2.3病菌侵染胁迫研究认为[52]，对每个栽培品种来说，增加菌种的密度都会导致Res合成能力的提高。10.2.4机械损伤果皮的机械损伤导致正常浆果合成Res能力下降。4.2.5杀菌剂Dercks等[53]在葡萄霜霉病方面研究了杀菌剂（Fosetyl）对Res的积累的影响，此研究包括两个内容，是否需接种病菌孢子及FosetyL-A1的使用时期。结论指出，接种与FosetyL-A1的使用，两种选择压力结合起来比单独用FosetyL-A1效果好；接种后使用FosetyL-A1可使Res的含量增加几倍。4.2.6化学元素、化合物使用粘酸（Mucicacid）可诱导Res的产生[54]；Coulmb-C等[89]在葡萄成熟后一天，喷布波尔多液和氢氧化铜，通过样品生化分析表明，浆果防御机能的综合指标提高，这些指标包括过氧化氢、酚、Res、花色素，得出铜可以帮助激发植物固有防御机能的结论。5展望Res不仅能够提高植物的抗病性，还具有多种生物活性和药理作用，有着广泛的研究和应用前景。提出几点今后的研究方向：（1）研究葡萄的种质，确定高Res含量基因型葡萄遗传规律，获得高含量Res葡萄新品种。运用现代分子技术以及遗传育种等手段深入研究葡萄种质，特别是野生葡萄种质Res含量特点及遗传规律，确定高Res含量基因型葡萄，通过遗传育种获得高含量Res葡萄新品种，以此来获取纯天然的Res。（2）Res抗病机理的研究。目前对于抗Res病机理研究尚不成熟，主要缺乏有效的工具来确定Res及其衍生物在植物细胞和组织中的转运/运输机制，因此对于Res及其衍生物在植物抗病中所起的作用很难评估。（3）由于不同的处理使得葡萄中白藜芦醇含量发生变化，因此可通过一定手段提高葡萄中白藜芦醇的含量。参考文献