邻苯二甲酸二乙基己酯DEHP对小鼠干细胞的毒性研究

邻苯二甲酸二乙基己酯（DEHP）对小鼠干细胞的毒性研究开题报告提纲一立论依据二课题意义三研究内容四实验方案五研究方法六技术路线七时间安排DEHP(diethylhexylphthalate),分子式：C24H38O4,分子量：390。熔点为255℃。无色具芳香气味液体，不溶于水，溶于乙醚，乙醇，矿物油等。结构式：一、立论依据DEHP是邻苯二甲酸酯中重要的一种，具有良好的抗静电和耐低温性能。从上世纪50年代起，为了生产出软化的塑料薄膜，人们开始在聚氯乙烯(PVC)的生产加工过程中广泛添加DEHP。随着经济和社会的快速发展，各种塑料制品的广泛使用，DEHP使用量迅速增加。已成为目前世界上使用量最多的塑料增塑剂。如橡胶管、血袋、化妆品、包装材料及玩具等物品中普遍添加DEHP，以增加弹性和抗拉力;DEHP作为芳香固定剂加入香水中，可以有效保持香水中的香味(Calafat,2006;ChinginK,2009)。DEHP在塑料制造过程中可释放至空气，也可在燃烧塑料制品过程中释放出来。DEHP渗透入土壤深部、湖泊或河流底部时，不易分解，存在时间较长。近几年，各国对大部分的河水、地下水、土壤和生物体中的DEHP进行监测。结果为日本东京自来水网管中DEHP质量浓度为0.06-1.8μg/L，地表水中DEHP浓度为43-46μg/L(Fatoki,2002)。德国地下水中DEHP含量为0.02-0.33μg/L(Penalver,2000;Casajuana,2003)。我国1999年对浙江10城市自来水水源及出厂水进行采样分析，结果表明水质均受到不同程度的污染(吴平谷,1999)。张付海等2007年对合肥市城市自来水进行检测，发现DEHP含量高达3.05μg/L(张付海，2008)。DEHP的人体暴露途径为经由食品、水、皮肤及呼吸空气接触，其中以食入为主，室内空气接触次之(Wittassek,2008)。DEHP可在加工过程中或是包装应用于储存食物时溶出，残留在食物中。涂料、地板中的DEHP可在房屋装修时释放进入空气。在塑料医疗制品中也会释出DEHP，用于输液或医用器械所用的管子会将DEHP传给病人。如经常透析的病人血液中及长期使用呼吸机的病人肺中DEHP的含量远高于正常人(Dhanya,2003)。资料表明，美国平均每日每天接触DEHP的重量达27mg，而这一数据并未包括特定作业工作环境接触和室内接触。伦敦食物安全协会在2000年调查指出，英国人DEHP每人每天摄入量平均为150μg，从食物中摄取的DEHP最高达300μg(Dey,2006)。另一调查显示，美国人每天DEHP食入量为5.8mg，日本人为2.1mg(Higgins,1997)。DEHP毒性的研究现状DEHP经口进入肠道后，一部分以原形直接吸收，另一部分在胰腺酶和肠道内酯酸酶的作用下转化为MEHP吸收。DEHP及其代谢产物通过血液分布于肝脏、肾脏、胃肠道及脂肪组织等。已有研究表明在大鼠生殖系统中浓度相对较高。目前的研究发现DEHP的毒性作用主要是表现在急性毒性，干扰内分泌功能，肝肾毒性，生殖生长毒性及潜在诱导肿瘤发生等。DEHP的急性毒性较低。各种动物体经口给药后，DEHP的半数致死量(LD50)较高。Sax和Lewis等报道经口给药后，小鼠的LD50为30g/kg,大鼠为30.6g/kg，家兔为34g/kg;小鼠、大鼠、鸽、兔、鸡静脉注射DEHP0.07-0.3g/kg可引起死亡;大鼠腹腔注射DEHP其LD50为5-30g/kg。DEHP对肝脏的影响主要表现在增加肝脏重量。Itsuki等研究发现，DEHP可引起雄性大鼠体重增加减缓、肾脏重量减轻，而肝脏重量较对照组增加(Itsuki-Yoneda,2007)。体内和体外的不同研究表明，DEHP具有弱雌激素样活性和器官毒性。Zacharewski等对多种邻苯二甲酸酯类物质进行检测，结果发现DEHP在体外高浓度时具有微弱的雌激素样活性(Kavlock,2002)。Stroheker等研究发现DEHP具有雌激素样活性，影响大鼠体内激素的合成并干扰体内激素发挥正常作用(Stroheker,2005)。对于DEHP是否具有致癌性，目前有许多不同的看法。美国国家毒理规划署的实验报道饮食长期暴露后，DEHP可诱发啮齿动物肝癌，同时DEHP及其代谢产物也可引起皇丸间质细胞肿瘤(Dees,2001)。DEHP可影响细胞分化、增殖过程并损伤细胞内DNA,从而启动和促进肿瘤的形成。国际癌症研究署和国家规划署曾根据DEHP为过氧化物酶体增殖物(PP)，将其列为人类可疑促癌剂。在多种动物实验研究中发现DEHP具有雄性生殖毒性。Park等研究发现DEHP可减低雄性小鼠睾丸的重量，对雄性大鼠睾丸可造成不可逆的损伤，可以导致不育。在雄性啮齿动物，DEHP导致输精管萎缩并降低睾丸重量、精子数量、睾丸锌的水平等(Park,2002)。关于DEHP的雄性生殖毒性机制，目前主要认为DEHP可通过抑制精子能量代谢中的某些关键酶，使精子能量代谢发生障碍，导致精子总数减少、精子畸形率上升。DEHP及其代谢产物进入睾丸后，支持细胞和间质细胞作为它们的靶点首先受到攻击，线粒体和内质网为主要受损细胞器，使得睾丸体积减小，这样就阻碍了精子的正常发生，但引起这一反应所需的浓度较高，足以引起肝肾的绝对和相对重量改变及引起胰腺和肝脏的组织学变化(Andriana,2004)。此外，DEHP可以影响体内锌的代谢，促进锌的排泄(Park,2004)。体内锌含量的降低势必影响雄性生殖功能。流行病学调查显示女性DEHP暴露和不良妊娠结局相关。在一些生产工厂或塑料加工厂附近，DEHP可对女工及女性居民的生殖健康产生不良影响。慢性职业性高水平DEHP暴露，可导致妊娠率降低，且流产率增高。Wittassek等发现在生产和处理塑料制品场所工作的妇女雌激素水平降低、不排卵，流产率高于其他人群(Wittassek,2007)。尽管职业暴露仅限于部分人群，但妇女在日常生活中常常暴露于含有DEHP的美容消费品中，导致普通妇女的DEHP暴露量增加(Adibi,2003;Berman,2009)。Cobellis等采用高效液相色谱法检测妇女体内DEHP含量，发现子宫内膜异位症的患者血浆中DEHP（0.57μgl/ml)高于对照组(0.18μg/ml)，结果表明DEHP与子宫内膜异位症具有相关性，认为邻苯二甲酸酯类物质可能是子宫内膜异位症的发病原因之一(Cobellis,2003)。到目前为止，邻苯二甲酸酯类对生殖功能影响的研究主要是以啮齿动物为研究对象，尚缺乏DEHP对人类生殖健康产生不良影响的研究，尤其缺乏DEHP对女性生殖功能影响的直接证据。因此，有必要进行DEHP对雌性生殖毒性影响的研究，并从细胞及分子生物学角度深入探寻DEHP生殖毒性的作用机制。综上所述，DEHP对机体的健康影响涉及急性毒性作用、慢性毒性作用、肝脏毒性、致癌性、生殖毒性等多种毒性。毒性机制复杂，多数实验只是通过体外观察实验现象，未通过体内生物分子实验验证机理。本研究以小鼠为研究对象，应用分子生物学和细胞生物学及免疫组织化学的方法，从分子水平和细胞水平研究其对细胞增殖、分化及在此过程中基因表达改变等的影响，以期对DEHP在细胞水平上的毒性及其影响得出较科学的评价。为环境保护和野生动物保护及人类健康等部门对DEHP的治理和检测提供参考和依据。为我国食品安全提供细胞水平毒性的实验依据。这对目前广受关注的食品安全问题的缓解意义重大。二、课题意义干细胞的分离、体外培养(加药)及鉴定DEHP对干细胞体外促凋亡作用研究DEHP对干细胞凋亡相关蛋白的影响DEHP对干细胞毒理作用及机制三、研究内容新生昆白小鼠分离、培养、鉴定出干细胞，设置空白对照组、加入不同浓度DEHP的实验组,观察DEHP诱导的干细胞形态的变化，检测各项毒性指标，选取引起干细胞显著损伤的浓度以进一步进行实验。四、实验方案对照组实验组(不同浓度的DEHP/mgL-1)DEHP浓度00.51.5625100收集时间72h后收集48h后加入不同浓度的DEHP，继续培养24h收集实验1结果实验2结果实验3结果实验4结果实验5结果1选用新生昆白小鼠，体外分离培养小鼠干细胞2HE染色，倒置显微镜下观察经不同浓度DEHP处理的干细胞形态的变化3MTT检测细胞活性4检测细胞氧化损伤中ROS的水平5琼脂糖凝胶电泳检测DNA损伤程度6RT-PCR检测凋亡相关基因bax、bcl-2、caspase的表达五、研究方法小鼠干细胞的体外分离培养常规免疫细胞化学方法鉴定小鼠干细胞药物处理细胞琼脂糖凝胶电泳法观察DNALadder流式细胞仪检测细胞凋亡情况流式细胞仪检测细胞周期分布用SPSS软件进行统计分析，小鼠干细胞诱导凋亡的影响Westernblot法检测Bax、Bcl-2及Caspase蛋白的表达情况WesternBlot法检测细胞周期调控蛋白的表达情况通过探明DEHP对细胞的药物作用以及观察凋亡相关蛋白表达的情况，进一步探明DEHP诱导小鼠干细胞凋亡诱导机制。MTT法检测DEHP对细胞生长抑制作用六、技术路线2012.2-2012.4查阅文献，整理实验方案，培养细胞，做一些实验准备工作。2012.5-2012.7干细胞的分离、培养和鉴定，DEHP对干细胞的毒性作用实验2012.8-2012.11探讨DEHP对损伤的干细胞的影响及其可能的机制2013.1-2013.4整理实验结果，撰写毕业论文七、实验安排参考文献[1]CalafatAM,McKeeRH.Integratingbiomonitoringexposuredataintotheriskassessmentprocess:phthalates[diethylphthalateanddi(2-ethylhexyl)phthalate]asacasestudy.EnvironHealthPerspect2006,114:1783-1789.[2]ChinginK,ChenH,GamezG,ZhuL,ZenobiR.Detectionofdiethylphthalateinperfumesbyextractiveelectrosprayionizationmassspectrometry.AnalChem2009,81:2414.[3]FatokiOS,NomalA.SolidPhaseExtractionMethodforSelectiveDeterminationofPhthalateEstersintheAquaticEnvironment.Water,Air,&SoilPollution2002,140:85-98.[4]PenalverA,PocurullE,BorrullF,MarceRM.Determinationofphthalateestersinwatersamplesbysolid-phasemicroextractionandgaschromatographywithmassspectrometricdetection.JChromatogrA2000,872:191-201.[5]CasajuanaN.Presenceandreleaseofphthalicestersandotherendocrinedisruptingcompoundsindrinkingwater.Chromatographia2003,57:649-656.[6]吴平谷，韩关根.饮用水中邻苯二甲酸酯类的调查.环境与健康杂志1999,16:338-340.[7]DhanyaCR,InduAR,DeepadeviKV,KurupPA.InhibitionofmembraneNa(+)-K+Atpaseofthebrain,liverandRBCinratsadministereddi(2-ethylhexyl)phthalate(DEHP)aplasticizerusedinpolyvinylchloride(PVC)bloodstorageba