董安华论文

PEG-硫酸铵双水相相平衡数据的关联及木瓜蛋白酶在该体系中分配模型的建立董安华，彭建，许英豪，张海德*(海南大学食品学院，海南海口邮编570228)摘要：用浊点法测定了聚乙二醇(2000、4000)-硫酸铵双水相体系在298.15K下的双节线和液液相平衡数据，建立了木瓜蛋白酶在PEG-(NH4)2SO4双水相体系的分配模型。采用Merchuk方程、Othmer-Tobisa方程和Bancroft方程对双节线数据、液液相平衡数据进行了关联，结果较为理想。分配系数的对数与上下相各组分的浓度差相关度较高，提出了木瓜蛋白酶分配系数与双水相成相组分浓度差的经验关系式，木瓜蛋白酶分配系数的计算值与实验值之间的相对偏差小于10%，说明实验建立的模型对木瓜蛋白酶在聚乙二醇(2000、4000)-硫酸铵双水相体系中关联效果较好。关键词：双水相；液液相平衡；分配模型；木瓜蛋白酶CorrectionofPEG-ammoniumsulfateaqueoustwo-phasesystemsandmodelingofpartitionofpapainDONGAn-hua，PENGJian，XUYing-hao，ZHANGHai-de*(CollegeofFoodScienceandTechnology,Haikou570228,China)Abstract：Theliquid-liquidequilibriumfortheaqueoustwo-phasesystemscontainingpoly(ethyleneglycol)2000/4000+poly(ethyleneglycol)2000/4000+ammoniumsulfatewasstudiedbycloudpointmeasurementatT=298.15K,andatheoreticalmodelwasestablishedtodescribethepartitionequilibriumofpapainintheaqueoustwo-phasesystems.Theexperimentalbinodaldataoftheaqueoustwo-phasesystemswerefittedbyMerchukempiricalnonlinearexpression.TheequilibriumdatawerecorrelatedusingtheOthmer-TobiasandBancraftequations.Theexperimentstudiedthecorrelationbetweenlogarithmofthepartitioncoefficientandtheconcentrationofeachcomponent,andestablishedanempiricalequation.Themeanrelativedeviationsbetweentheexperimentalandcalculatedofpapainpartitioncoefficientwere10%.Experimentalresultsdemonstratedthereliabilityofthemodel.Keywords：aqueoustwo-phasesystem;liquid-liquidequilibrium;partitionmodel;papain双水相体系(Aqueoustwo-phasesystem)是指某些亲水性的高分子聚合物与聚合物或聚合物与无机盐溶解在水中，超过一定浓度能自然的分成互不相溶的两相或多相的体系[1]。双水相由于其萃取条件温和，易于放大，容易操作等特点，已广泛的应用于核酸、蛋白质和病毒等生物产品的分离纯化，是极有前途的新型分离技术[2-4]。虽然该技术在应用方面取得了较大的进展，但是关于双水相系统的形成机理及生物物质在其中的分配行为的理论探讨仍十分薄弱[5]。近年来，对双水相体系相平衡及分配系数的研究十分活跃。MohammedTaghiZafarani等[6]用Othmer-Tobias和Bancroft方程对聚乙烯吡咯烷酮3500-硫酸钠双水相相平衡数据进行了关联，结果较理想。谢国红等[7]用一个修饰的多元维里渗透模型描述了TritonX-100-无机盐双水相体系的相平衡，基金项目：国家自然科学基金(31260401)；作者简介：董安华(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：天然产物的提取*通信作者：张海德(1970-)，男，教授，研究方向：天然产物的提取研究表明模型模拟效果较好。对于双水相分配系数的模型近年来也时有报道。MirjanaA等[8]研究了果胶酶在PEG-Na2SO4双水相系统中的分配行为，采用响应面实验设计方法建立了统计学模型，预测果胶酶分配比与双水相成相剂的关系。Diamond和Hsu[9]关联了PEG-葡聚糖体系的分配系数与PEG的质量分数，结果表明对于双聚合物体系分配系数的预测效果较好。目前关于木瓜蛋白酶双水相萃取研究主要集中在双水相体系优化这个阶段，对于其分配理论的研究报道比较少。本文采用浊点法测定了PEG-(NH4)2SO4在298.15K下的双节线及相平衡的数据，并用通过经验方程对数据进行了关联；研究了木瓜蛋白酶分配系数与双水相体系特征值的相关度，并建立了木瓜蛋白酶在该体系中的分配系数模型。1材料与方法1.1材料与试剂木瓜蛋白酶(BR)生物生工有限公司；PEG2000(化学纯)、PEG4000(化学纯)国药集团化学试剂有限公司；硫酸铵(分析纯)、甲醛溶液(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)广州化学试剂厂；其他均为市售分析纯。1.2仪器与设备TU1901紫外可见分光光度计北京普析通用有限责任公司；DK-98-1型恒温水浴锅天津泰斯特仪器有限公司；PHS-3C型pH计上海雷磁仪器厂；阿贝折射仪上海光学仪器一厂。1.3方法1.3.1双节线的测定利用浊点滴定法测定双节线的组成，在298.15K恒温条件下进行操作。取一定量已知浓度的不同分子量的PEG放在100ml的小烧杯里，向其中滴加已知浓度的(NH4)2SO4溶液，同时利用磁力搅拌器进行搅拌直到溶液出现浑浊，变为两相区。算出浊点时溶液各组分的质量百分含量。再向浑浊溶液中滴加去离子水，直至溶液变为澄清，变为单相区，再继续滴加已知浓度的(NH4)2SO4溶液直到下一个浑浊点出现，反复重复上述操作。1.3.2液-液相平衡数据的测定以相图为指导，选取大致适当的点配置溶液，将溶液加入50ml的离心管中，在恒温振荡器上震荡半小时，在25℃下放置2.5h，待溶液分相完全，体系达到平衡。上下相中(NH4)2SO4的质量分数由甲醛滴定法[10]来确定，PEG的质量分数由测得的折射率[11]来确定。折射率n，PEG的质量分数pw，(NH4)2SO4的质量分数sw，三者之间的关系为：spwawaan210(1)方程参数见表1。1.3.3双水相萃取木瓜蛋白酶及其酶活的测定双水相体系按质量进行配置，各组分用质量分数表示，体系总质量为20g，木瓜蛋白酶的添加量为20mg，体系pH值固定为7，恒温震荡30min混合均匀，体系在25℃下静置分相。以酪蛋白为反应底物，在275nm测定上下相的吸光值，计算上下相木瓜蛋白酶的酶活U[12]，按1.3.2方法测定上下相各组分的含量。表1PEG2000/4000+(NH4)2SO4双水相方程(1)参数Table1ParametersEquation(1)forPEG2000/4000+AmmoniumSulfateaqueoustwophasesystem0a1a2a1.3310PEG2000，1.51×10-3(NH4)2SO4，1.47×10-3PEG4000，1.47×10-32结果与分析2.1双节线数据的关联采用1.3.1的方法测定PEG-(NH4)2SO4双水相体系中双节线上的数据，并通过Merchuk方程对实验数据进行关联。35.0expsspcwbwaw(2)a、b、c为经验方程参数，pw和sw分别代表PEG和(NH4)2SO4的质量分数.近年来，Merchuk方程已经成功的用于聚合物/盐和离子液体/盐双水相双节线数据的关联。Merchuk经验方程形式简洁，比Pitzer、Cabezas等半经验半理论的热力学模型具有更广泛的实际应用价值[13]。相关系数(R2)和标准偏差(sd)见表2。表2298.15K时PEG2000/4000+(NH4)2SO4双节点关联结果Table2CorrelationresultsofsolubilityforPEG2000/4000+AmmoniumSulfatesystemat298.15KNwwsdNipcalpa21exp，N是双节点的数目691215081624PEG4000%(NH4)2SO4%48120102030PEG2000%(NH4)2SO4%图1T=298.15K温度下PEG-(NH4)2SO4双水相双节曲线Fig1BinodalcurveforthePEG-(NH4)2SO4systemat298.15K2.2利用Othmer-Tobias和Bancroft方程对液液平衡数据进行关联Othmer-Tobias和Bancrof经验关联方程[14]的表达式如下：nbsbstptWWKWW1-1p（3）PEG分子量abc2RasdPEG200088.87-0.496.14×10-40.99920.25PEG400062.29-0.357.35×10-40.99950.1rtptwbsbWWKWW1w（4）tWp代表上相中PEG的质量分数，bsW代表下相中(NH4)2SO4的质量分数，twW，bWw代表上相、下相中水的质量分数，K，1K，n和r为方程参数，见表3。表3PEG2000/4000+(NH4)2SO4双水相方程(3)和方程(4)中的参数Table3ParametersofEquations3and4forPEG2000/4000+AmmoniumSulfateaqueoustwophasesystemPEG分子量Kn2R1Kr'2R20000.30391.30270.99942.48940.78770．998040000.23541.42430.99632.81510.7010.99420.400.450.500.550.600.650.700.750.800.850.00.10.20.30.40.50.6PEG2000实验值PEG4000实验值PEG2000拟合线PEG4000拟合线lg[(1-Wpt)/Wpt]lg[(1-Wsb)/Wsb]图2Othmer-Tobias方程的线性相关性Fig2LineardependencyoftheOthmer-Tobiasequation0.00.10.20.30.40.50.400.450.500.550.600.650.700.750.80PEG2000实验值PEG4000实验值PEG2000拟合值PEG4000拟合值lg(Wwb/Wsb)lg(Wwt/Wpt)图3Bancroft方程的相关性Fig3LineardependencyoftheBancroftequation线性相关系数(2R)表明Othner-Tobias方程和Bancrof方程可以很好的关联相平衡的数据。由回归参数和下相各组分质量分数可以计算上相各组分的质量分数，结果见表4，做图2，图3。PEG2000和PEG4000的平均相对误差分别为0.0059%，-0.3%。(NH4)2SO4的平均绝对误差分别为-0.018%，-0.08%。可见，方程拟合结果较好。表4298.15K时PEG2000/4000+(NH4)2SO4双水相液液相平衡拟合结果Table4theresultofLiquid-LiquidEquilibriaforPEG2000/4000+AmmoniumSulfateaqueoustwoph